逆转录 -聚合酶链 反应 （RT-PCR） Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
实验目的 实验原理 实验过程 注意事项
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1、了解RT-PCR的原理、反转录酶的特性 2、掌握RT-PCR的基本操作过程 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数 量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可 能。该技术主要用于：分析基因的转录产 物、获取目的基因、合成c. DNA探针、构建 RNA高效转录系统等。
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r. RNA(80 -85%)；t. RNA(15 -20%)； m. RNA(1 -5%)
随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录 本的多个位点 退火，产 生短的，部分长 度的c. DNA。这 种方法经 常用于获 取 5'末端序列及从 带 有二级结 构区域或带 有逆转录 酶不能复制的终 止位点的RNA模板获 得 c. DNA。为 了获 得最长 的c. DNA，需要按经验 确定每个RNA样 品中引物与RNA 的比例。随机引物的起始浓 度范围为 50到 250 ng每 20μl反应 体系。因为 使用 随机引物从总 RNA合成的c. DNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选 用 poly(A)+RNA。 Oligo(d. T)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细 胞m. RNA 3'端所发 现 的poly(A)尾杂 交。因为 poly(A)+RNA大概占总 RNA的1%到 2％，所以与使用 随机引物相比，c. DNA的数量和复杂 度要少得多。因为 其较 高的特异性， oligo(d. T)一般不需要对 RNA和引物的比例及poly(A)+选择进 行优 化。建议 每 20μl反应 体系使用 0. 5μg oligo(d. T)。oligo(d. T)12 -18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对 于逆转录 步骤 是特异性最好的引物。GSP是 反义 寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂 交，而不象随机引物或 oligo(d. T)那样 同所有RNA退火。用于设计 PCR引物的规则 同样 适用于逆转录 反应 GSP的设计 。GSP可以同与m. RNA 3'最末端退火的扩 增引物序列相同，或 GSP可以设计为 与反向扩 增引物的下游退火。
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反转录体系 第一步： 0. 5 ml离心管中 模板RNA 2 u. L d. NTP 2 u. L oligod. T 2 u. L DEPC水补充到 14 u. L 70℃ 5 min 4 ℃ 第二步： 5×buffer 4 u. L 0. 1 mol/L的DTT 1 u. L Rnase Inhibitor 混匀，离心，42 ℃孵育 2 -5分钟； 逆转录酶M-MLV 1 u. L 42 ℃中，水浴 60 min； 95 ℃ 5 min 终止反应； -20 ℃保存备用。 10 min；短暂离心；
聚合酶链反应 PCR (Polymerase Chain Reaction) It simulates the replication of DNA and makes it happen continuously
历 1983. 4 Kary Mullis在开 车前去北加利福尼亚红树 县 Redwood country的 一 条被月光笼罩的山路上构 思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格： 10, 000$ 1993 Nobel prize 史
PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) • PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概 念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的 技术，后者又上升成为新的概念。 … • 它最大的特点就是能不断推出新形式。 • —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow] • •
什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治 革命和科学革命)加以说明。……它的发明并 没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们 能在更广的范围内更快、更容易地进行基 因操作，学术界也完全不用等到某人死去 或退休后才能接受PCR。它只不过是一种 新 具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis)
PCR及有关技术的发展历史 1983，Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日 第一次成功实验）发明了PCR。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 • • 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的 应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛 查
PCR发明过程的简单回顾
PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～ 97℃ 退火 45～ 55℃ 延伸 72℃左右 PCR过程 一生二，二生四，四生万物
PCR 循环 – 第一步 – 加热变性 靶序列
PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 1 Primer 2 Biotin 5’ Biotin 3’ 5’ 3’ 靶序列
PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 1 Taq DNA Polymerase Primer 2 Biotin 5’ 3’ Biotin 3’ 5’ 靶序列
第 1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列 Biotin 靶序列
30次循环后靶序列扩增的数量 No. of Cycles No. Amplicon Copies of Target 2 cycle = 4 Amplicon 1 2 3 cycle = 8 Amplicon 2 4 4 cycle = 16 Amplicon 3 8 5 cycle = 32 Amplicon 4 16 5 32 6 64 20 1, 048, 576 30 1, 073, 741, 824 1 cycle = 2 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon
Compare PCR with DNA Replication 解链方式 PCR Topoisomerase Heating 引 物 RNA primer DNA primer 延 伸 DNA polymerase I Taq DNA polymerase 反应数 细胞分裂一次 Continuously DNA复制一次 25 -30 cycles
PCR反应体系的五要素： 引物 酶 d. NTP 模板 Mg 2+
引物决定了PCR产物的特异性 引物的设计应遵循一定的原则 ¬ 一对引物，对应于欲扩增序列的上游及下游 Sense and Antisense ¬ 长度： 15～ 30个核苷酸 ¬ 引物内、引物间不应有互补序列 ¬ 尽量保障引物与非特异扩增区无同源性
• 引物的Tm值：引物－模板双链体的解链温度。 Tm＝ 4（G+C）+2(A+T) 决定于引物的长度及碱基的组成。 退火温度和Tm值是影响模板与引物结合的关键 • 引物的3’端： 应当尽量没有错配 避免为T，以免发生错配； 避免用A，防止结合自由能太低，影响延伸效率； 避免用GC多组合。
Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 良好的耐热性 Mg 2+依赖性 Thermusaquaticus Taq DNA聚合酶的一个致命的弱点是它的 出错率，一般PCR中出错率为 2*10^－4核苷 酸/每轮循环
• 在 100μl PCR反应中, 1. 5 -2单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30轮循环. • 所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的 变化进行适当的增减. 酶量过多会使产物非 特异性增加, 过少则使产量降低.
4种三磷酸脱氧核苷酸(d. NTP) • 一般反应中每种d. NTP的终浓度为 20 -200μmol/L。 理论上4 种 d. NTP各20μmol/L, 足以在 100μl反应 中合成 2. 6μg的DNA。 • 当d. NTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合 酶的活性. 4种d. NTP的浓度应该相等, 以减少合成中 由于某种d. NTP的不足出现的错误掺入。
模板 • PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以 是单链分子, 也可以是双链分子, 可以是线状分子, 也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效 果稍好). • 就模板DNA而言, 影响PCR的主要因素是模板的数量 和纯度. 一般反应中的模板数量为 10^2 -10^5 个 拷贝, 对于单拷贝基因, 这需要0. 1μg的人基因组. 扩增多拷贝序列时, 用量更少. 灵敏的PCR可从一个 细胞, 一根头发, 一个孢子或一个精子提取的DNA中 分析目的序列. 模板量过多则可能增加非特异性产 物. DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
Mg 2+ • Mg 2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大, 它可 影响①酶的活性和真实性, 影响②引物退火 和解链温度, 影响③产物的特异性以及引 物二聚体的形成等。 • 通常Mg 2+ 浓度范围为 0. 5 -2 mmol/L. 对于一 种新的PCR反应, 可以用 0. 1 -5 mmol/L的递增 浓度的Mg 2+ 进行预备实验, 选出最适的Mg 2+ 浓度。
PCR反应的过程： There are 3 main steps in the replication of DNA 1、DNA双链解离为单链。（double strands） 2、引物的合成。(primer synthesize) 3、DNA链的延伸。(extention) single
Also 3 steps in PCR 1, Denaturation(变性)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂， DNA双链解离形成单链。 Heating +
2，Annealling（退火）：当温度突然降低时，引物与其互补的 模板按碱基配对的原则在局部形成杂交链。 + 3, Extention（延伸）：在DNA聚合酶的作用下，以引物为起 点， DNA链按5’ 3’的方向延伸。
PCR反应的程序设计： 程序设置： 94℃ Xs 55℃ Xs 72℃ Xs X个循环 （一般在 72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达 35～ 100个核苷酸/秒） 72℃ 5 m 一般在扩增反应完成后, 都需要一步较长时间(1090 min)的延伸反应, 以获得尽可能完整的产物, 这 对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
PCR中的注意事项 PCR反应中可能出现的问题： • 假阴性，不出现扩增条带 • 假阳性 • 出现非特异扩增带
PCR中的注意事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及 作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阴性对照： 试剂对照： 阳性模板 阴性模板 除模板外的所有组分
PCR的反应特点 1. 特异性强 2. 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增 加的，能将pg=10 - 12级的起始待测模板扩增 到微克( g= 10 -6)水平 3. 简便、快速：PCR反应一般在 2～ 4 小时完成 扩增反应 4. 对标本的纯度要求低： DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用 临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组 织等扩增检测
管家基因(house-keeping genes)， 是所有细胞中均要表达的一类基因， 其产物是对维持细胞基本生命活动 所必需的。如微管蛋白基因、糖酵 解酶系基因与核糖体蛋白基因等。 是指在生物体内所有细胞中都表达， 并且为维持细胞基本生命活动所需 而时刻都在表达的高度保守的基因。
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1. 逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解。 2. 成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆 转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾 染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾 染的基因组DNA。因此在进行PCR反应时应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照 反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组DNA还是c. DNA。在无逆转录时所得到的PCR 产物来源于基因组。 3. RT-PCR的起始模板可是总RNA或m. RNA，都可以检测到扩增结果。 4. 在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白以增加c. DNA合成的长度和产量。RNA酶抑制 蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入，因为c. DNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋 白仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了 这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。 5. 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板， 在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在 65 -70 ℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可 以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使 热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶，使逆转 录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR 的特异性。 6. 建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后将全部反 应物涡旋混匀；上PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。 7. PCR反应的循环数一般 25 -30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的 浪费。复性温度的计算，一般是在引物的Tm值上下浮动，Tm =2(A+T)+4(G+C)。适当提 高复性温度可提高PCR扩增的特异性。
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