Загальні принципи культивування тваринних клітин Переваги культивованих

Загальні принципи культивування тваринних клітин

Переваги культивованих клітин n n n n Можливість прижиттєвого спостереження клітин за допомогою мікроскопа. Використовуються здорові клітини, вони зберігають життєздатність протячгом всього експерименту. Культури клітин – однорідні популяції клітин, що ростуть в постійних умовах. Експериментальні умови в культурі контролюються більш суворо, ніж в організмі можна оцінювати ефекти певних хімічних речовин і факторів на ріст клітин певного типу одинична клітина може легко розростатися в колонію (клітинне клонування Істотні результати можуть бути отримані при використанні дуже нвеликої кількості клітин. (Експерименти, що використовують 100 щурів або 1000 людей статистично 100 культур in vitro) Досліджувані речовини (лікувальні препарати, гормони, . токсини, радіоактивні мітки та ін. можуть бути введені в заданій концентрації і протягом заданого періоду. Кількість їх може бути на декілька порядків меньше, ніж при експериментах на тваринах.

Використання в наукових і практичних галузях Генетика • • Клонування Зберігання і злиття клітин Отримання мутантних колітин і робота з ними. Імунологія Гібридомна технологія: клітини, що продукують специфічні антитіла. Біотехнологія Цінне джерело гормонів і інших секретованих речовин. Вірусологія і трансформація клітин Можливість вирощувати віруси в культурах клітин. Дослідження процесів вірусної трансформації клітин Ідентифікація вірусів, так и для их использования в получении вакцины. Механізми росту і диференціації Визначення цитотоксичності Тестування і вивчення механізмів дії різних речовин, які можуть бути використані як лікарські препарати, детергенти, косметичні засоби, інсектицициди, консерванти (неповна екстраполяція). зменшення кількості експериментальних тварин, оцінка токсичності на людських клітинах Більша відтворюваність результатів, ніж in vitro.

Обладнання культуральної лабораторії n СО 2 -інкубатор

Ламінарний бокс 1. Включення/ виключення потоку повітря. 2. Включення/ виключення світла або УФ. 3. Регулювання швидкості потоку стерильного поваітряі з задньої стінки ламінара. 4. Лампа денного світла і УФ- лампа. 5. Задня стінка з фільтром, через яку здійснюється подача стерильного повітря 6. Стіл ламінару з металевою поверхнею

Лабораторний посуд n Пластикові планшети n n Чашки Петрі Скляні флакони n n Плоскодонні пляшки Посудина Карреля

ПОЖИВНІ ПОТРЕБИ ТВАРИННИХ КЛІТИН В КУЛЬТУРІ Середовища за призначенням: n n Ростові активне розмноження клітин Підтримуючі переживання клітин в сфомованій культурі Середовища багатокомпонентні. Можуть включати: n природні продукти (амніотичну рідину, сироватки тварин), n субстрати, отримані в результаті часткової обробки природних продуктів (ембріональні екстракти, гідролізат лактальбуміну, гемогідролізат і т. д. ), n синтетичні хімічно чисті речовини (амінокислоти, вітаміни, солі).

Основні компоненти n n n n 9 незамінних амінокислот +Цис, глютамін і тирозин вітаміни, солі; глюкоза; сироватка Несироваткові фактори (еритропоэтин , интерлейкин 2 (IL-2) тощо) антибіотики

Індикатори n Phenol Red контроль кислотності середовища протягом експерименту. Помутніння середовища або зміна кольору індикатора на жовтий або червоно-синій (малиновий) може свідчити про зараження середовища культури клітин мікроорганізмами.

n Трипсин, версен – застосовують для дезагрегації моношару клітин при пересіванні клітинної культури або для виділення клітин з тканин при отриманні первинних культур.

Типи культивованих клітин n n n n Фібробласти - елементи сполучної тканини Клітини кістки і хряща - скелетні тканини М’язові клітини – гладенькі, серцеві, посмуговані м’язи епітеліальні клітини - (печінка, легені, сечовий міхур, нирки) Нервові клітини - (нейрони, гліальні клітини) Ендокринні клітини - (наднирники, гіпофіз, клітини острівців Лангерганса тощо) Меланоцити Пухлинні клітини

Диференціювання клітин n Сприяють розмноженню диференціації без : n низька щільність культури, невисока концентрація Ca 2+, Наявність ростових факторів (фактор росту епідерміса - EFG, фактор росту фібробластів FGF, фактор росту, синтезований тромбоцитами – PDGF). n n n Припиняють розмноження , сприяють диференціації : Висока щільність клітин (> 105 кл на 1 см 2) і концентрація Ca 2+ (300— 1500 мк. М); наявність індукторов диференціювання (гормони - гідрокортизон, фактор дозрівання глії, фактор росту нервів, ретиноїди; полярні розчиннки, зокрема диметилсульфоксид - ДМСО). Диференціація олігодендроцитів - низькі концентрації сироватки диференціація бронхіального епителія в зроговілий - високі концентрації сироватки.

Залежність клітин від прикріплення до субстрату

Топографія поверхні нормальних і трансформованих фібробластів в культурі (Скан-ЕМ) Ø Ø Ø а - нормальний фібробласт миші в рідкому середовищі. Сферична клітина з численними пухирчастими вип’ячуваннями на поверхні. Х 3800; б - нормальний мишачий фібробласт, що прикріпився до плаского дна посудини. Клітина розпласталась на субстраті, її поверхня стала гладенькою. Попереду - сплощена ламела, позаду - вузьке тіло клітини. х 1600; в - трансформоваий мишачий фібробласт, що прикріпився до плаского дна посудини. Клітина погано розпласталась, її поверхня не стала пласкою. На ній видні численні короткі ворсинки, а на концах відростків - фестончасті псевдоподії. Х 800

n n Схема взаємовідносин між клітинами і волокнами матриксу в нормальній сполучній і епітеліальній тканині

Загальні компоненти позаклітинного матриксу в різних тваринних тканинах колагенові фібрилярні білки; n гіалуронан (гіалуронова кислота), великий кислий мукополісахарид; n протеоглікани і глікопротеіди - поєднані ковалентними зв’язками полісахариди і білки n

Фібронектин – білок міжклітинного впізнавання і клітинної адгезії n n Структура димера фібронектина: Ділянки зв’язування з: 1 - колагеном, 2 - клітиною, 3 - гепарином cig ( Cold insoluble globulinнерозчинний на холоді глобулін CSP (Cell surface protein клітинний поверхневий білок

Регуляція розмноження клітин в культурі n n n У клітин, що не розмножуються ядра не забарвлені, у клітин в мітотичному циклі червоні а, б - нормальні клітини: а – в мітотичний цикл вступила лише клітина, що прикріпилася до поверхні дна посуду, б – залежність розмноження від щільності культури. Серед клітин, що прикріпилися, розмножуються лише ті, які межують з вільною поверхнею субстрату в, г –пухлинні клітини розмножуються без опори в рідкому середовищі (в) і на субстраті незалежно від кількості сусідів

Контактне гальмування n Відновлення клітинних поділів після руйнування клітинного моношару Продовження росту ракових клітин після заповнення поверхні субстрата (моношар), Ділянки наповзання клітин

n n n Два пухлинних клона серед клітин нормального епітелію. Клітини клону, що формує доброякісну пухлину - поліп (темно-коричневий), дають надлишковий ріст і утворюють вип’ячування над поверхнею пласта, але не проникають в сполучну тканину під епітелієм. Клітини злоякісного (ракового) клону (червоні) проникають під базальну мембрану в сполучну тканину

n Рис. Упрощенная схема фокального контакта клетки с матриксом. Молекулы - рецепторы белков матрикса (Р) наружной частью прикрепляются к волокнам матрикса, а на внутренней стороне мембраны те же рецепторы через посредство специальных белков - линкеров (Л) соединяются с концами актиновых филаментов цитоскелета (зеленый цвет), которые могут натягивать контакт. В фокальных контактах содержатся также специальные регуляторные белки (киназы - К), которые могут присоединять фосфат к другим белкам, меняя состояние и прочность контакта. Красным пунктиром обозначены гипотетические цепи проведения сигналов от фокальных контактов. Через ряд промежуточных белков (красные круги) такие цепи могут активировать размножение клеток и вызывать образование новых псевдоподий на поверхности клетки