ХРОМАТОГРАФИЯ Аспирант 3 го года обучения Николаев А

ХРОМАТОГРАФИЯ Аспирант 3 го года обучения Николаев А. Ю.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ (ВЭЖХ) ( «ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ» ) ПРИНЯТО НАЗЫВАТЬ МЕТОД КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ, В КОТОРОМ ПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙ (ПФ) СЛУЖИТ ЖИДКОСТЬ, А РАЗМЕР ЧАСТИЦ СОРБЕНТОВ ОБЫЧНО СОСТАВЛЯЕТ 3– 10 МКМ ВАРИАНТЫ ВЭЖХ ПО МЕХАНИЗМУ РАЗДЕЛЕНИЯ : АДСОРБЦИОННАЯ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ИОНООБМЕННАЯ ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХИРАЛЬНАЯ

ОБЩЕПРИНЯТЫЕ ТЕРМИНЫ ПРЯМОФАЗНАЯ ВЭЖХ ПРЯМОФАЗНЫМ НАЗЫВАЮТ КЛАССИЧЕСКИЙ АДСОРБЦИОННЫЙ ВАРИАНТ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ, В КОТОРОМ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ПОЛЯРНЫЙ СОРБЕНТ (НАПРИМЕР, СИЛИКАГЕЛЬ ИЛИ СИЛИКАГЕЛЬ С ПРИВИТЫМИ NH 2 - ИЛИ CN-ГРУППАМИ) И НЕПОЛЯРНАЯ ПФ (НАПРИМЕР, ГЕКСАН ИЛИ ГЕПТАН С РАЗЛИЧНЫМИ ДОБАВКАМИ) ОБРАЩЕННО-ФАЗНАЯ ВЭЖХ В ОБРАЩЕННО-ФАЗНОМ ВАРИАНТЕ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ИСПОЛЬЗУЮТ НЕПОЛЯРНЫЕ ПРИВИТЫЕ СОРБЕНТЫ (ПРИВИТАЯ ФАЗА ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ НЕПОЛЯРНЫЙ АЛКИЛЬНЫЙ РАДИКАЛ ОТ C 2 ДО C 18) И ПОЛЯРНЫЕ ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ (НАПРИМЕР, МЕТАНОЛ И АЦЕТОНИТРИЛ, ВОДУ, БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ)

РЕЗУЛЬТАТ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ОБЫЧНО ПРЕДСТАВЛЯЕТСЯ В ВИДЕ ХРОМАТОГРАММЫ ХРОМАТОГРАММОЙ НАЗЫВАЮТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПЯТЕН, ЗОН ИЛИ ПИКОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТАМ ИСХОДНОЙ СМЕСИ ПОСЛЕ ИХ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ. ДЛЯ ЛЮБОГО ТИПА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА, В КОТОРОМ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТА ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЕТЕКТОР, ХРОМАТОГРАММА ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ГРАФИК ЗАВИСИМОСТИ СИГНАЛА ДЕТЕКТОРА, ПРОПОРЦИОНАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАЦИЯМ РАЗДЕЛЯЕМЫХ КОМПОНЕНТОВ, ОТ ВРЕМЕНИ (КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ) ИЛИ РАССТОЯНИЯ (ПЛАНАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ)

Пример хроматограммы

ХРОМАТОГРАММА СОСТОИТ ИЗ ПИКОВ, РАЗДЕЛЕННЫХ БАЗОВОЙ ЛИНИЕЙ. БАЗОВАЯ ЛИНИЯ соответствует сигналу только от подвижной фазы ПИК – кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распределения, которая описывает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ДАННЫХ ti – время удерживания компонента – соответствует времени появления максимума пика на хроматограмме, где i – индекс, соответствующий i-му компоненту разделяемой смеси. При точном воспроизведении параметров хроматографической системы время удерживания является величиной, постоянной для данного вещества

t 0 – время удерживания несорбирующегося компонента t. R = ti − t 0 – приведенное (исправленное) время удерживания компонента Rr – относительное время удерживания компонента 2 по компоненту 1 t 1 и t 2 – времена удерживания двух компонентов, измеренные от момента инжекции r – относительное удерживание компонента 2 по компоненту 1

k = (ti – t 0)/t 0 – коэффициент емкости колонки по i компоненту W – ширина пика у основания (для пиков, описываемых гауссовым законом распределения, W = 4 ) W 0, 5 – ширина пика на половине высоты (для пиков, описываемых гауссовым законом распределения, W 0, 5 = 2, 35 ) R – разрешение между пиками двух компонентов смеси или

ПРИ R ≥ 1, 5 КОМПОНЕНТЫ РАЗДЕЛЕНЫ ПОЛНОСТЬЮ (ДО БАЗОВОЙ ЛИНИИ) ЕСЛИ КОМПОНЕНТЫ СМЕСИ РАЗДЕЛЯЮТСЯ НЕ ПОЛНОСТЬЮ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЮТ СООТНОШЕНИЕ (21) Hp – высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии; Hv – высота низшей точки (седловины) кривой, разделяющей пики, относительно экстраполированной базовой линии Hp Хроматограмма не полностью разделяемых компонентов Hv

N – ЧИСЛО ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ТАРЕЛОК (22) или (23)

СХЕМА ЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФА

Основные узлы жидкостного хроматографа 1. УЗЕЛ ПОДГОТОВКИ ПФ, ВКЛЮЧАЯ ЕМКОСТЬ С ПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙ (ИЛИ ЕМКОСТИ С ОТДЕЛЬНЫМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ, ВХОДЯЩИМИ В СОСТАВ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ) И СИСТЕМУ ДЕГАЗАЦИИ ПФ; 2. НАСОСНАЯ СИСТЕМА; 3. СМЕСИТЕЛЬ (ПРИ НЕОБХОДИМОСТИ); 4. СИСТЕМА ВВОДА ПРОБЫ (ИНЖЕКТОР); 5. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ КОЛОНКА (МОЖЕТ БЫТЬ В ТЕРМОСТАТЕ); 6. ДЕТЕКТОР; 7. СИСТЕМА СБОРА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

НАСОС ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ

СХЕМА ИНЖЕКТОРА ТИПА REODINE

КОЛОНКА ДЛЯ ВЭЖХ ДИАМЕТР ПОР ФИЛЬТРОВ 2 – 5 мкм ДЛИНА КОЛОНКИ 10 – 30 см (ОБЫЧНО 25 см) ВНУТРЕННИЙ ДИАМЕТР 2 – 10 мм (ОБЫЧНО 4, 6)

ДЕТЕКТОРЫ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕНЫ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ ДЕТЕКТОРЫ, В ТОМ ЧИСЛЕ ДИОДНО-МАТРИЧНЫЕ ОБЛАСТЬ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ: 190 – 900 нм САМЫЙ ПРОСТОЙ – ДЕТЕКТОР С ПЕРЕМЕННОЙ ДЛИНОЙ ВОЛНЫ

СХЕМА РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКОГО ДЕТЕКТОРА

Основные принципы действия

Обращенно-фазовая система

Обращенно-фазовая система Полярные вещества элюируются раньше, чем неполярные.

Нормально-фазовая система

Разметка пиков

Разметка не полностью разрешенных пиков

Разметка хроматограммы на фоне дрейфа базовой линии

Хроматографическое разделение Основные параметры Вещество Температура Элюент Условия хроматографического разделения: Нормально фазовая хроматография: Обращенно фазовая хроматография: • Вода метанол • Диполь индуцированный диполь; • Диполь диполь; • Образование водородных мостиков; • Образование π комплексов • Ацетонитрил – вода У смесей вода – метанол высокий максимум вязкости!!! Преимущества: • Подходит для градиентного элюирования Плохо подходят для градиентного элюирования!!! • Можно разделять как полярные, так и совсем неполярные вещества

Оптимизация растворителя Метод подбора Постепенная оптимизация Компьютерная оптимизация Интерпретирующий метод

Эксклюзионная хроматография (SEC) – метод жидкостной хроматографии, позволяющий анализировать олигомеры и полимеры. При использовании органических элюентов метод становится гельфильтрационной хроматографией (GFC). При использовании водных элюентов метод становится гельпроникающей хроматографией (GPC). SEC – хроматография определяет распределение ММ в области 102 107 Da.

Эксклюзионная хроматография SEC – хроматография разделяет молекулы по гидродинамическому объему. Разделение обусловлено простой сортировкой молекул по размерам.

Эксклюзионная хроматография • все введенные молекулы будут элюированы; • хроматографирование закончено, когда из колонки элюируется неудерживаемый компонент (мертвое время). Таким образом, заранее известно, как долго будет проходить разделение; • время элюирования зависит только от размера молекулы, но вместе с тем пусть даже косвенно от ее молекулярной массы. Гельфильтрацию можно использовать для определения молекулярной массы; • так как разделение заканчивается уже после прохождения небольшого объе ма, пиковая емкость (т. е. количество пиков, которые могут быть разделены с определенным разрешением) ограничена; • чтобы молекулы двух разных масс можно было разделить друг от друга, их молярные массы должны отличаться минимум на 10%; • с ростом времени удерживания не происходит уширения пиков; • поскольку в системе отсутствуют какие либо равновесные взаимодействия, то колонку едва ли можно перегрузить. Можно разделять относительно боль шие пробы.

Эксклюзионная хроматография Механизм разделения

Эксклюзионная хроматография Стирол мономер Межгранульный объем Мертвый объем

Эксклюзионная хроматография • Разделительная емкость • Верхний предел эксклюзии • Нижний предел эксклюзии • Диапапзон линейности

Эксклюзионная хроматография Соответствие распределения пор по объему градуировочной кривой эксклюзионной фазы

Эксклюзионная хроматография