Хроматографические методы анализа химических и биологических объектов
Основные даты и этапы развития хроматографии • • 1901 -1906 гг. – М. С. Цвет – разделение пигментов, входящих в состав хлорофилла (жидкостная адсорбционная хроматография) 1927 г. – А. А. Брандт – применение ионообменников (цеолитов) для определения cульфат-ионов 1938 г. – Н. А. Измайлов и М. С. Шрайбер – разработка метода тонкослойной хроматографии 1941 г. – А. Дж. Мартин и Р. Синдж – разработка метода распределительной хроматографии, в основу которого легло различие в коэффициентах распределения веществ между двумя несмешивающимися жидкостями (Нобелевская премия 1952 г. ) 1946 г. – Р. Синдж – предложен метод жидкостной хроматографии с липофильной неподвижной фазой (жидкостная хроматография на обращенной фазе) 1947 г. – Т. Б. Гапон, Е. Н. Гапон и М. Ф. Шемякин – разработан метод ионообменной хроматографии 1952 г. – А. Мартин и Джеймс – первые результаты в области газожидкостной хроматографии 1956 г. – М. Голей – осуществлено разделение на капиллярной колонке
Сущность хроматографического метода • Хроматография – метод, используемый для разделения компонентов одной пробы, в процессе которого происходит их распределение между двумя фазами – неподвижной и подвижной. • В основе хроматографии – сорбционные процессы: сорбция (адсорбция, абсорбция) и десорбция. Сорбция – поглощение газов, паров или растворенных веществ твердыми или жидкими поглотителями (сорбентами). • Хроматография – метод, основанный на процессе многократного повторения актов сорбции и десорбции вещества при его перемещении в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента
Основные определения • Подвижная фаза - поток жидкости, флюида или газа, перемещающий компоненты разделяемой смеси вдоль неподвижной фазы. • Неподвижная фаза - твердый сорбент или несмешивающаяся с подвижной фазой жидкость, на которых осуществляется дифференцированное удерживание и разделение компонентов смеси. • Сорбент - твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и использующиеся в хроматографии в качестве неподвижной фазы. • Адсорбент - твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества. • Абсорбент - твердый или жидкий сорбент, растворяющий в своем объеме газы, пары или компоненты жидких смесей. • Сорбат - вещество, удерживаемое сорбентом (в хроматографии компонент разделяемой смеси). • Элюент - жидкость, флюид или газ, используемые в качестве подвижной фазы. • Элюат - выходящий из колонки поток подвижной фазы с компонентами разделяемой смеси веществ.
Классификация хроматографических методов 1. По агрегатному состоянию подвижной и неподвижной фаз ПОДВИЖНАЯ ФАЗА ГАЗ НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА ВИД ХРОМАТОГРАФИИ Газо-адсорбционная Жидкость Жидкостно-жидкостная Твердое тело (адсорбент) Жидкостноадсорбционная Твердое тело (пористый сорбент - гель) Жидкостно-гелевая (Эксклюзионная) Ионит Ионообменная Сорбент с иммобилизированным аффиантом ФЛЮИД Газо-жидкостная Твердое тело (адсорбент) ЖИДКОСТЬ Жидкость Аффинная (биоспецифическая) Жидкость Сверхкритическая флюидная Твердое тело (адсорбент)
Классификация хроматографических методов 2. По механизмам разделения Виды хроматографии Характер взаимодействия между сорбентом и сорбатом Адсорбционная (молекулярная) хроматография На различии сорбируемости на сорбенте различных компонентов разделяемой смеси Хемосорбционная хроматография За счет образования водородной связи, проявления химического сродства и др. Распределительная хроматография На разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе Ионообменная хроматография На различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой и компонентами разделяемой смеси Лигандообменная хроматография За счет образования координационных связей разделяемых органических молекул с катионами металлов в привитых на поверхности адсорбента группах (лигандах) Ситовая (эксклюзионная) хроматография По размеру молекул Аффинная хроматография За счет образования прочного комплекса только с одним из разделяемых компонентов с привитой специфической группой неподвижной фазы
Классификация хроматографических методов 3. По применяемой технике анализа: 1) 2) Колоночная хроматография – разделение веществ в специальных колонках (все механизмы разделения) Плоскостная хроматография: а) бумажная – разделение веществ на хроматографической бумаге (распределительный и ионообменный механизмы); б) тонкослойная – разделение веществ в тонком слое сорбента (все механизмы разделения)
Классификация хроматографических методов 4. По способам перемещения фаз Проявительный (элюентный) • • Фронтальный • Вытеснительный
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ Хроматограмма – зависимость сигнала детектора от времени. 1 – нулевая линия, полученная при регистрации сигнала детектора во время выхода чистого газа-носителя или растворителя; 2 – пик несорбирующегося компонента; 3 – пик, полученный при регистрации сигнала во время выхода определяемого компонента.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ • Время удерживания t. R - время от момента ввода пробы до момента регистрации максимума хроматографического пика • Приведенное время удерживания t. R‘ пересчитывают с учетом поправки на время удерживания несорбирующегося компонента t 0: t R‘ = t R – t 0 • Объем удерживания VR – объем подвижной фазы, прошедший через колонку со скоростью F(мл/мин), необходимый для элюирования вещества: VR = F∙ t. R • Приведенный объем удерживания: V‘R = VR – V 0 = F(t. R – t 0) • Коэффициент емкости (фактор удерживания) колонки по отношению к данному компоненту k' = V‘R / V 0 = (t. R - t 0 ) / t 0. Для эффективного разделения k‘ = 1, 5 - 4
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ Эффективность колонки – степень размывания хроматографического пика характеризуется числом теоретических тарелок N или высотой, эквивалентной теоретической тарелке Н. Чем меньше Н (<1, 5 мм) и больше N, тем эффективность колонки выше и пики более узкие Н = L / N, где L – длина колонки N = 16(t. R / t. W)² = 5, 54(t. R / t. W 1/2 )², где t. R – время удерживания компонента, tw – ширина пика у основания tw 1/2 – полуширина пика Разрешение характеризует разделение двух соседних пиков. Разделение двух компонентов считается полным, если RS >1, 5 Разрешение зависит от: фактора разделения (коэффициента селективности α) фактора удерживания (коэффициента емкости k') колонки. α = t'R 2 /t'R 1 = V'R 2/V'R 1 = k'2/k'1 Для разделения двух веществ необходимо, чтобы α >1
Качественный анализ в хроматографии Качественной характеристикой определяемых веществ являются их времена удерживания (объемы удерживания) и другие характеристики удерживания. Для целей идентификации используют корреляционные зависимости параметров удерживания с физикохимическими свойствами соединений в гомологическом ряду (числом метиленовых групп, t кип). Для идентификации компонентов исследуемых смесей в хроматографии используют относительное время удерживания t‘Rотн или относительный удерживаемый объем V‘Rотн где t. Ri и t. Rст – измеренные времена удерживания i-го компонента и компонента, принятого за стандарт.
Идентификация компонентов в газовой хроматографии Логарифмические индексы удерживания Ковача где t. R(n) и t. R(n+1) – времена удерживания н-алканов с числом углеродных атомов n и n+1; t′R(n) и t′R(n+1) – исправленные времена удерживания этих же алканов; t. R 0 – время удерживания несорбирующегося компонента; t. R(x) и t′R(x) - измеренное и исправленное время удерживания компонента Х. Должно соблюдаться условие: Индексы удерживания н-алканов равны числу углеродных атомов, умноженному на 100. Нулевое значение индекса приписывается водороду гипотетическому углеводороду с нулевым числом атомов углерода. Таким образом, для метана логарифмический индекс удерживания равен 100, для этана – 200, для пропана – 300, для н-бутана – 400 и т. д.
Количественный анализ в хроматографии 1. 2. Метод абсолютной калибровки предполагает построение градуировочного графика (Si – ci) по стандартным смесям. В методе внутренней нормализации предполагается, что пики всех возможных компонентов смеси зафиксированы на хроматограмме, и сумма их площадей (S) равна 100%. Различия в чувствительности детектора к разным компонентам учитывается введением поправочных коэффициентов (Ki): где n - число компонентов смеси, S - площадь хроматографического пика, Ki - поправочные коэффициенты для каждого i-компонента. где h - высота пика, tw - ширина пика у основания, tw ½ - полуширина пика, m - масса компонента в пробе, k - коэффициент пропорциональности
Количественный анализ в хроматографии 3. 1) 2) 3) Метод внутреннего стандарта 6 Хроматографирование эталонных смесей, включающих известные массы определяемого компонента и стандарта. Площадь пика пропорциональна массе вещества: поправочный коэффициент Хроматографирование анализируемого раствора с добавкой известной массы стандарта и измерение площадей пиков а) строят градуировочный график Sх/Sст – mх/mст б) с использованием найденного поправочного коэффициента к рассчитывают отношение масс и, зная массу стандарта, вычисляют определяемого вещества.
Газовая хроматография Подвижная фаза Неподвижная фаза Высокомолекулярная водоро жидкость, закрепленная на д, пористый носитель гелий, или на стенки азот, капиллярной трубки аргон, Твердое пористое углекис вещество, лый заполняющее колонку ГАЗ газ Вид хроматографии Анализируемые объекты Рабочая температура Газожидкостная Органические и неорганические газообразные, жидкие, твердые соединения (М< 400), которые могут быть переведены в газовую фазу без разложения 20 - 400°С Газоадсорбционная 70 - 600° С
Принципиальная схема газового хроматографа 1 – источник газа-носителя и блок подготовки газов; 2 – устройство дозирования и ввода пробы; 3 – колонка; 4 – детектор; 5 – система регистрации сигнала.
Блок подготовки газа-носителя Назначение: установка, стабилизация и измерение потоков газа-носителя и дополнительных газов, питающих детекторы, а также очистка газов.
Устройства ввода пробы Назначение: введение в хроматографическую колонку определенного количества анализируемой смеси (пробы).
Хроматографические колонки НАЗНАЧЕНИЕ: разделение многокомпонентной анализируемой смеси на индивидуальные компоненты. В зависимости от расположения неподвижной фазы колонки делятся: 1) насадочные, которые содержат адсорбент (ГАХ) или инертный твердый носитель, обработанный жидкой неподвижной фазой 2) капиллярные: открытые (незаполненные) (WCOT columns) − классические; открытые с пористым слоем (PLOT columns); открытые с твердым носителем (SCOT columns). Параметр Насадочные Капиллярные Поликапиллярные Длина колонки, м 1 -6 10 -100 0, 4 -1, 2 Внутренний диаметр, мм 2 -4 0, 25 -0, 35 0, 01 -0, 1 пакет из 1000 и более капилляров Среднее число 5000 теоретических тарелок 150000 10000 Толщина пленки, мкм 0, 005 -0, 5 0, 005 -0, 05 1 -10
Хроматографические колонки
Детекторы в газовой хроматографии Назначение: обнаружение и количественное определение выходящих из колонки в потоке подвижной фазы компонентов анализируемой смеси. Регистрация вещества осуществляется за счет преобразования в электрический сигнал изменений химических или физико-химических свойств потока, выходящего из хроматографической колонки. Детекторы в ГХ могут быть условно разделены на: 1. - неионизационные (ДТП, ДТХ ДПФ) и ионизационные (ДПИ, ДЭЗ, ДТИ, ДФИ, МС и др. ). 2. - недеструктивные и деструктивные. 3. - универсальные и селективные.
Основные типы детекторов в газовой хроматографии и принцип их работы Наименование детектора Принцип работы По теплопроводности (ДТП) Регистрируется различие в теплопроводности анализируемого вещества и газа-носителя Термоионный, щелочнопламенно-ионизационной (ДТИ) Образование и регистрация ионов в водородном пламени в присутствии ионов щелочного металла (Na, Cs, K, Rb) Пламенно-фотометрический Возбуждение анализируемого вещества в пламени и (ДПФ) излучение света в зависимости от типа присутствующего в веществе элемента По плотности (ДП) Пламенно-ионизационный (ДПИ) Регистрируется различие плотностей смеси анализируемого вещества с газом-носителем и чистого газа-носителя Образование и регистрация ионов при сгорании анализируемых веществ в пламени Фотоионизациониый (ДФИ) Фотохимическое образование и регистрация ионов под действием УФ - излучения на анализируемое вещество Электронозахватный (ДЭЗ) Захват анализируемым веществом тепловых электронов, образованных при облучении β-частицами или высокоэнергетическими электронами газа-носителя
Основные типы детекторов в газовой хроматографии и принцип работы Наименование детектора Детектор электролитической проводимости по Холлу (ДЭПХ) Принцип работы Тепловое выделение из анализируемых веществ органических и неорганических ионов, определение электрической проводимости растворов ионов Масс-спектрометр (МС) Образование молекулярных и фрагментарных ионов при электронном ударе или химической ионизации Ультрафиолетовый (УФД) Поглощение УФ - света специфическим хромофором анализируемого вещества Пламеннофотометрический (ДПФ) Атомно-абсорбционный спектрометр (ААС) Анализатор термоэнергии (АТЭ) Электрохимический (ЭХД) Возбуждение анализируемого вещества в пламени и излучение света в зависимости от типа присутствующего в веществе элемента Тепловая атомизация с последующим поглощением света на специфической длине волны Тепловое разложение нитрозоаминов с выделением оксида азота, который при реакции с озоном дает хемилюминисценцию Поглощение анализируемых веществ потоком жидкости и их электрохимическое детектирование
Пламенно-ионизационный детектор (ПИД) - слабая реакция на воду - отсутствие чувствительности к неорганическим соединениям, инертным газам и водороду - применение для анализах примесей органических веществ в воздухе, сточных и природных водах, биологических объектах. Газ (A) из колонки хроматографа поступает в ПИД. В части B поддерживается высокая температура, для того чтобы смесь оставалась в газообразном состоянии. Смешавшись с водородом (С), газ поступает в форсунку горелки детектора (Е), горение поддерживается за счёт поступления кислорода (D). Пламя (F) ионизует газ, находящийся в пространстве между электродами (G, H). Ионизованные частицы уменьшают сопротивление и резко усиливают ток, который измеряется очень чувствительным амперметром. Продукты сгорания выходят через отверстие J.
Катарометр (детектор по теплопроводности) ДТП измеряет различие в теплопроводности чистого газа-носителя и смеси газа-носителя с веществом, выходящим из хроматографической колонки. - чувствительность катарометра зависит от теплопроводности газа-носителя (гелий), - различает аргон, кислород, азот, диоксид углерода, что невозможно сделать, например, в ПИД
Скачать презентацию Хроматографические методы анализа химических и биологических объектов
Хроматографические методы анализа.ppt