Хозяева (( Hosts )) , ,

Хозяева (( Hosts )) , , векторы и ферменты (( основные орудия генной инженерии )) Что такое хозяин ? ? Типы хозяев (хостов) Что такое вектор ? ? Типы векторов Важные ферменты

Типы хозяев Прокариоты бактерии ( & & Archaea )) Eukaryotes: Дрожжи Первичные клеточные культуры (( животных или растений )) Выведенные клеточные линии (( животных или растений )) Животные Растения Хозяева ? ? Микроорганизм (включая вирусы), также культивируемые клетки или (в некоторых случаях целый организм), который поддерживает клонируемый вектор или ДНК-конструкцию.

Важные бактериальные хозяева: Escherichia coli K 12 * & & ее формы : : XL-1 -Blue (Tc. R) JM 105 (rec. A 1) DH 5 (( recrec A 1) Bacillus subtilis 168 * Agrobacterium tumefaciens ** (* (* геном полностью секвенирован ))

Важные дрожжевые хозяева: Saccharomyces cerivisiae S 288 C * ( гаплоидный штамм )) D 273 -10 B — меньшее число мутаций в мт. ДНК Schizosaccharomyces pombe

Животные клеточные культуры и линии: Ткань Ферменты разрушают внеклеточный матрикс Клетки Помещаются в комплексную ростовую среду Образуется монослой (прекращается деление) Субкультивирование (50 -100 генераций-поколений )) Потеря возможности делиться и прогр. кл. смерть мутация Продолжение деления & & неограниченное культивирование и рост Первичные клеточные культуры Клеточная линия

Растения тотипотентны и могут размножаться вегетативно и семенами, все клетки способны к бесконечному росту и делению при определенной гормональной обработке (обычно 1 м. М ауксина + 1 м. М цитокинина)

Что такое вектор ? ? Компоненты базового вектора: Это молекула ДНК, которая способна функционировать внутри клетки хозяина. . Функциональная база репликации позволяет реплицироваться вектору в клетке хозяина ии // илиили позволяет интеграцию в ДНК хозяина Сайты клонирования (( рестрикции )) желательно уникальные позволяют встраивать тестируемую ДНК в вектор Селективные маркеры например, гены устойчивости к антибиотикам или особым ростовым условиям (например, температуре) это позволяет произвести селекцию клеток хозяина со встроенным вектором

Типы векторов Плазмидные вектора : : — общего назначения — с большим кол-вом копий — шатл-веткора (несколько хозяев) — экспрессионные вектора — вектора, несущие пробу промотера — суицидальные вектора (для селекции) Бактериофаговые вектора: — производные фага лямбда — космидные вектора — дрожжевые искусственные хромосомы (YACs) — бактериальные искусственные хромосомы (BACs)

Вектора общего назначения p. BR 322 (( E. coli )) Основные характеристики : : база репликации Col. E 1 (ori. V) – участок начала репликации элементы: Tc. Tc RR изиз p. SC 101 & Ap RR изиз Tn Tn 33 размер 4. 3 kb 20 -30 копий на клетку (amplifiable) ““ уникальные ” ” сайты рестрикции в участке устойчивости к Антибиотикам Bolivar et al. , 1977 Gene 2: 75 -94.

Вектора для общих целей клонирования p. BR 322 (( E. coli ))

Векторы с большим кол-вом копий A) A) Векторы p. UC (p. UC 18/19) Основные характеристики : : участок начала репликации из Col. E 1 ( ori. V )) ген устойчивости к ампицилину А mpmp RR длина 2. 7 kb 200 -300 копий на клетку MCS — Multi-cloning site – сайт множественного клонирования (( в пределах lac. Z -гена )) отбор (скрининг) по цвету «голубой – белый» , благодаря разрыву MCS вв lac. Z Messing 1983 Meth. Enzymol. 101: 20 -78.

Шатл-вектора (с переменным хозяином) В)В) E. coli — — Agrobacterium tumefaciens (( бинарные (Bin) вектора ) ) p. BIN 19 oriori из плазмиды RK 2 длядля Agrobacterium ии E. coli p. Green – серия плазмид с 2 2 oriori -участками : Col. E 1 ( длядля E. coli ) ) ии p. Sa ( длядля Agrobacterium )) способны реплицироваться в более, чем одном хозяине 2 функциональных начала репликации ( oriori )) клонирование генов может быть произведено в E. coli , а затем перенесено в другого хозяина A) A) E. E. coli — — Bacillus subtilis ББ )) E. coli — Saccharyomyces cerevisiae YIp vectors Yeast integrative plasmid vectors YEp vectors Yeast episomal plasmid vectors YCp vectors Yeast centromere plasmid vectors p. HB 201: p. BR 322 oriori & p. TA 1060 oriori p. HV 1248: p. BR 322 ori & p. E 194 oriori

Col. EI orinpt. I -ген (( устойчивости к канамицину )) Между левой границей ( left border — — LB) и правой границей ( right border RB) встраиваются гены. . Они называются T-T- ДНКДНК и переносятся в ядро растений. Плазмида p. Green ( вектор: E. coli — Agrobacterium – – Растение ))

Фаговые вектора Исторически являются производными бактериофага лямбда ( ( )) , сейчас также производные фага P 1 P 1 Удобны для клонирования фрагментов по 10 -15 kb (125 kb вв P 1) ~ 45 kb всего может быть упаковано в головку фага Можно устранить гены лизогенного цикла Участки, несущественные для репликации замещаются тестируемой ДНК Имеет т. н. «липкие концы» (когезивные концы) в сайте « cos arms » » — — 200 bpbp из них 12 имеют разрезы (устранена фосфогруппа; cos. N site ) – это обеспечиваюет рециклизацию фага — липких концах образуется Участок, который легко разрезается и деспиралиуется этот участок Рекомбинантная ДНК упаковывается in vitro в фаговые головки Отбор по пятнам в культуре E. Coli (плак – выемка, пятно)

литический цикл лизогенный цикл

Cos ends (липкие концы) Участок cos. N в ДНК фага лямбда: Фермент терминаза разрезает его следующим образом : : Образуется одноцепочная ДНК (2 фрагмента – собственно липких конца) : :

Космиды Это гибридные вектора, содержащие плазмидные и фаговые компоненты Повышает длину колируемого фрагмента до 4545 kbkb (плазмида обычно до 20 kbkb )) Cos ends (липкие концы) фага добавляются к плазмиде Космиды могут существовать как плазмиды in vivo , , или быть упакованы в фаговые головки in vitro

Дрожжевые вектора 3 класса : : Эписомальные вектора (( дрожжевая эписомальная плазмида YEp) — — плазмидные вектора — — реплицируются автономно в дрожжах — 2 участка начала репликации (2 (2 oriori ). ). — — высокое кол-во копий и вероятность трансформации Интегрированные вектора (( интегративные вектора Yp. I ) — — не реплицируются автономно — — медленно интегрируются в геном при помощи гомологичной рекомбринации Yeast artificial chromosomes ( искусственная дрожжевая хромосома ))

Yeast artificial chromosomes (( искусственные дрожжевые хромосомы )) Емкость для клонирования от 200 kb додо 2 Mb Позволяют физическ ии охарактеризовать большие геномы Состоят из : : ценромер требуются для разъединения хроматид при митозе и мейозе участок начала репликации : : последовательность автономной репликации ( autonomous replicating sequence — — ARS) теломеры требуются для полной репликации линейных молекул и защиты от нуклеаз селективные маркеры (( один или более) по крайней мере один уникальный сайт рестрикции поддерживаются как отдельные стабильные хромосомы в клетках дрожжей Burke et al. , 1987 Science 236: 806 -812.

p. Y

Основаны на участке длиной 7 kb плазмиды F F E. Coli и и селекционной системы lac. Z’ из плазмиды p. UC Размер вставок (ёмкость клонируемой ДНК) – 150150 -300 kb kb Чрезвычайно стабильны, 1 -2 копии на клетку Shizuya et al. , 1992 PNAS (USA) 89: 8794 -8797 Другие варианты : : PACs (P 1 -derived artificial chromosomes) – в основе бактериофаг Р 1 — — емкость до 300 kb. Ioannou et al. , 1994 Nature Genet. 6: 84 -89. Фосмиды ( ( в основе — FF -плазмида + участок coscos )) Kim et al. , 1992. Nucl. Acids Res. 20: 1083 -1085. Бактериальные искусственные хромосомы (BACs)

Обычные плазмиды могут быть использованы как интеграционные вектора для гомологичесокй рекомбинации in vivo Требуется последовательность, которая распознает мишень в геноме хозяина Ген селективного маркера, который работает в хозяине Такой подход используется для бектерий, дрожжей, животной ядерной ДНК и растительного хлоропластного генома. Однако он пока не имел успеха для растительного ядерного генома. Плазмида, несущая вставоную ДНК, окруженную гомологичными участками, схожими с ДНК хозяина Сайт-мишень в геноме хозяина. Рекомбинация между гомологичными последовательностями

Важные ферменты, используемые в генных и белковых технологиях Полимеразы ДНК-полимераза РНК-полимераза РНК-зависимая ДНК-полимераза Нуклеазы Эндогуклеазы рестрикции Экзонуклеазы ДНКазы РНКазы ДНК-лигазы Фосфатазы

ДНК-полимеразы Полимеразы http: //www. learnerstv. com/animation/animation. php? ani=169&cat=biology Удлиняют ДНК от 3´ 3´ -конца путем добавления единиц деоксирибонуклеозид-монофосфатов к свободному концу 3´-OH Требования : : цепочка-темплейт ДНК праймер со свободным концом 3´-OH 4 деоксирибонуклеозид трифосфата Используются в ДНК-репликации и репарации Примеры : : ДНК-полимераза II Taq -полимераза Применения : : ПЦРПЦР секвенирование ДНК и т. д.

РНК-полимеразы удлиняют РНК от 3´ 3´ конца добавлением единиц деоксирибонуклеозид-монофосфатов к свободному концу 3´-OH праймеры не нужны служат для транскрипции генов применяются для мечения РНК-зондов РНК-зависимая ДНК-полимераза она же обратная транскриптаза использует молекулу РНК как темплейт для синтеза комплиментарной цепочки ДНК требует праймеры обнаруживается в РНК-вирусах (( ретровирусах )) пример – RTh -полимераза применяется в синтезе к. ДНК и ПЦР

Нуклеазы Эндонуклеазы — — ферменты, гидролизующие полинуклеотид в середине молекулы Эндонуклеазы рестрикции Это класс бактериальных ферментов, расщепляющих обе цепочки молекулы ДНК в особом месте последовательности. . Могут оставлять или тупые или липкие концы. Сайты распознавания различной длины Например, Alu I I режет по 4 bp по по CAGT Eco RI RI режет по 6 bp по по GAATTC Not II режет по 8 bp по по GCGGCCGC Это ферменты, которые гидролизуют полинуклеотид. . Обычно (но не всегда) оставляя концы 5′-P ии 3′-OH.

Экзонуклеазы — — фермент, который гидролизует концевой остаток полинуклеотида ДНКаза (( ДНаза — DNase) — — фермент, который гидролизует ДНК неспецифично (т. е. в любом месте молекулы) Используется при очистке РНК для «уничтожения» “ “ contaminating DNA” – «загрязненяющей ДНК» РНКаза (( Рназа — RNase) — — фермент, который гидролизует РНК Используется при очистке ДНК для деградации РНК Также при клонировании к. ДНК also для конвертирования РНК-ДНК-дуплекса в одноцепочную ДНК ( ss. DNA ))

ДНК-лигаза — — фермент, который «берет» ДНК с открытым фосфатно-сахарным концом и создает ковалентную связь – «закрывает» молекулу – наиболее наспространенная ДНК-лигаза T 4 T 4 (бактериофага), она используется при лигировании и клонировании. cloning) 5’-5’- NNNNNN GG -3’ 5’- AATTC NNNNNN -3’-3’- NNNNNN CTTAA -5’ 3’- GG NNNNNN -5’ 5’-5’- NNNNNN GAATTC NNNNNN -3’ 3’-3’- NNNNNN CTTAAG NNNNNN -5’-5’ДНК-лигаза T 4 T 4 Фосфатаза — фермент, который удаляет 5’-P из полинуклеотида –– например, Calf Intestinal Alkaline Phosphatase используется для обработки линеаризованных плазмид для предотвращения религации

Gateway ®® — система для рекомбинации in in vitro ( ( Invitrogen – фирма-произв. )) Использует ферменты рекомбинации из бактериофага для соединения молекул ДНК вместе по определенным участкам последовательности, называемым сайты attatt , , по которым идет интеграция (встраивания) фага в ДНК E. coli (при формировании профага) Сайты Att B B – этолько 25 bp Реакция очень быстрая in vitro (( в течение минут )) Не треуются ферменты рестрикции (рестриктазы) Эффективность — 90 -99%, приблизительно каждая плазмида получает вставку Используется негативная селекция для плазмид без успешной вставки Эффективность не зависит от размеров вставки или плазмиды Может быть автоматизирована для массового клонирования генов – например, всех генов генома Киты дорогие , , поэтому пока используется не часто Постоянно появляются новые ферментативные системы Marsischky and La. Baer 2004 для анализа

Сайты att могут быть введены в любую плазмиду и вставка с полезными (клонируемыми) генами может легко быть передана (если надо) от плазмиды к плазмиде Все происходит in vitro , , т. е. без клеток Особенная простота при негативной селекции – только плазмиды со вставкой не разрушаются

Первичный вектор ( «входящий» — е ntry vector ) – в нем ваш ген впервые клонирован (( типично это ПЦР-продукт) Конечный вектор – это куда вы в конце концов переносите вставку « « In vitro -рекомбинация» реализуется смесью ферментов (( рекомбиназами) , , начальная плазмида имеет сайт att. P , конечная сайт att. L , который больше не распознается ферментами и поэтому остается в конечной плазмиде.

Дополнительная литература и ссылки Glick, B. R. & Pasternak, J. J. (1998) ‘Molecular Biotechnology’. Chapter 3 Brown, T. A. (1999) ‘Genomes’ pp 73 -75. Sambrook et al. , (1989) ‘Molecular Cloning’ Chapters 1 -5. Bolivar et al. , 1977 Gene 2: 75 -94. Messing 1983 Meth. Enzymol. 101: 20 -78. Shizuya et al. , 1992 PNAS (USA) 89: 8794 -8797. Ioannou et al. , 1994 Nature Genet. 6: 84 -89. Kim et al. , 1992. Nucl. Acids Res. 20: 1083 -1085. Burke et al. , 1987 Science 236: 806 -812. Hellens et al. , 2000 Trends Plant Science 5: 446 -451 Marsischky and La. Baer 2004 Genome Research 14: 2020 -2028 Vector database Invitrogen vectors Yeast vectors Invitrogen Gateway site (http: //www. invitrogen. com/Content/Online%20 Seminars/gateway/1. htm)