Хозяева Hosts векторы и ферменты основные орудия генной

Хозяева (Hosts), векторы и ферменты (основные орудия генной инженерии) Что такое хозяин? Типы хозяев (хостов) Что такое вектор? Типы векторов Важные ферменты

Хозяева? Микроорганизм (включая вирусы), также культивируемые клетки или (в некоторых случаях целый организм), который поддерживает клонируемый вектор или ДНК-конструкцию. Типы хозяев Прокариоты бактерии (& Archaea) Eukaryotes: Дрожжи Первичные клеточные культуры (животных или растений) Выведенные клеточные линии (животных или растений) Животные Растения

Важные бактериальные хозяева: Escherichia coli K 12 * & ее формы: XL-1 -Blue (Tc. R) JM 105 (rec. A 1) DH 5 (rec. A 1) Bacillus subtilis 168 * Agrobacterium tumefaciens * (* геном полностью секвенирован)

Важные дрожжевые хозяева: Saccharomyces cerivisiae S 288 C * (гаплоидный штамм) D 273 -10 B -меньшее число мутаций в мт. ДНК Schizosaccharomyces pombe

Животные клеточные культуры и линии: Ткань Ферменты разрушают внеклеточный матрикс Клетки Помещаются в комплексную ростовую среду Образуется монослой (прекращается деление) Субкультивирование (50 -100 генераций-поколений) мутация Потеря возможности делиться и прогр. кл. смерть Первичные клеточные культуры Продолжение деления & неограниченное культивирование и рост Клеточная линия

Растения тотипотентны и могут размножаться вегетативно и семенами, все клетки способны к бесконечному росту и делению при определенной гормональной обработке (обычно 1 м. М ауксина + 1 м. М цитокинина)

Что такое вектор? Это молекула ДНК, которая способна функционировать внутри клетки хозяина. Компоненты базового вектора: Функциональная база репликации позволяет реплицироваться вектору в клетке хозяина и/или позволяет интеграцию в ДНК хозяина Сайты клонирования (рестрикции) желательно уникальные позволяют встраивать тестируемую ДНК в вектор Селективные маркеры например, гены устойчивости к антибиотикам или особым ростовым условиям (например, температуре) это позволяет произвести селекцию клеток хозяина со встроенным вектором

Типы векторов Плазмидные вектора: - общего назначения - с большим кол-вом копий - шатл-веткора (несколько хозяев) - экспрессионные вектора - вектора, несущие пробу промотера - суицидальные вектора (для селекции) Бактериофаговые вектора: - производные фага лямбда - космидные вектора - дрожжевые искусственные хромосомы (YACs) - бактериальные искусственные хромосомы (BACs)

Вектора общего назначения p. BR 322 (E. coli) Основные характеристики: база репликации Col. E 1 (ori. V) – участок начала репликации элементы: Tc. R из p. SC 101 & Ap. R из Tn 3 размер 4. 3 kb 20 -30 копий на клетку (amplifiable) “уникальные ” сайты рестрикции в участке устойчивости к Антибиотикам Bolivar et al. , 1977 Gene 2: 75 -94.

Вектора для общих целей клонирования p. BR 322 (E. coli)

Векторы с большим кол-вом копий A) Векторы p. UC (p. UC 18/19) Основные характеристики: участок начала репликации из Col. E 1 (ori. V) ген устойчивости к ампицилину Аmp. R длина 2. 7 kb 200 -300 копий на клетку MCS - Multi-cloning site – сайт множественного клонирования (в пределах lac. Zгена) отбор (скрининг) по цвету «голубой – белый» , благодаря разрыву MCS в lac. Z Messing 1983 Meth. Enzymol. 101: 20 -78.

Шатл-вектора (с переменным хозяином) способны реплицироваться в более, чем одном хозяине 2 функциональных начала репликации (ori) клонирование генов может быть произведено в E. coli, а затем перенесено в другого хозяина A) E. coli - Bacillus subtilis p. HB 201: p. BR 322 ori & p. TA 1060 ori p. HV 1248: p. BR 322 ori & p. E 194 ori Б) E. coli - Saccharyomyces cerevisiae YIp vectors Yeast integrative plasmid vectors YEp vectors Yeast episomal plasmid vectors YCp vectors Yeast centromere plasmid vectors В) E. coli - Agrobacterium tumefaciens (бинарные (Bin) вектора) p. BIN 19 ori из плазмиды RK 2 для Agrobacterium и E. coli p. Green – серия плазмид с 2 ori-участками: Col. E 1 (для E. coli) и p. Sa (для Agrobacterium)

Плазмида p. Green (вектор: E. coli - Agrobacterium – Растение) npt. I-ген (устойчивости к канамицину) Col. EI ori Между левой границей (left border - LB) и правой границей (right border RB) встраиваются гены. Они называются T-ДНК и переносятся в ядро растений.

Фаговые вектора Исторически являются производными бактериофага лямбда ( ), сейчас также производные фага P 1 Удобны для клонирования фрагментов по 10 -15 kb (125 kb в P 1) ~ 45 kb всего может быть упаковано в головку фага Можно устранить гены лизогенного цикла Участки, несущественные для репликации замещаются тестируемой ДНК Имеет т. н. «липкие концы» (когезивные концы) в сайте «cos arms» - 200 bp из них 12 имеют разрезы (устранена фосфогруппа; cos. N site) – это обеспечиваюет рециклизацию фага - липких концах образуется Участок, который легко разрезается и деспиралиуется этот участок Рекомбинантная ДНК упаковывается in vitro в фаговые головки Отбор по пятнам в культуре E. Coli (плак – выемка, пятно)

литический цикл лизогенный цикл

Cos ends (липкие концы) Участок cos. N в ДНК фага лямбда: Фермент терминаза разрезает его следующим образом: Образуется одноцепочная ДНК (2 фрагмента – собственно липких конца):

Космиды Это гибридные вектора, содержащие плазмидные и фаговые компоненты Повышает длину колируемого фрагмента до 45 kb (плазмида обычно до 20 kb) Cos ends (липкие концы) фага добавляются к плазмиде Космиды могут существовать как плазмиды in vivo, или быть упакованы в фаговые головки in vitro

Дрожжевые вектора 3 класса: Эписомальные вектора (дрожжевая эписомальная плазмида YEp) - плазмидные вектора - реплицируются автономно в дрожжах - 2 участка начала репликации (2 ori). - высокое кол-во копий и вероятность трансформации Интегрированные вектора (интегративные вектора Yp. I ) - не реплицируются автономно - медленно интегрируются в геном при помощи гомологичной рекомбринации Yeast artificial chromosomes (искусственная дрожжевая хромосома)

Yeast artificial chromosomes (искусственные дрожжевые хромосомы) Емкость для клонирования от 200 kb до 2 Mb Позволяют физически охарактеризовать большие геномы Состоят из: ценромер требуются для разъединения хроматид при митозе и мейозе участок начала репликации: последовательность автономной репликации (autonomous replicating sequence - ARS) теломеры требуются для полной репликации линейных молекул и защиты от нуклеаз селективные маркеры (один или более) по крайней мере один уникальный сайт рестрикции поддерживаются как отдельные стабильные хромосомы в клетках дрожжей Burke et al. , 1987 Science 236: 806 -812.

p. YAC 3

Бактериальные искусственные хромосомы (BACs) Основаны на участке длиной 7 kb плазмиды F E. Coli и селекционной системы lac. Z’ из плазмиды p. UC Размер вставок (ёмкость клонируемой ДНК) – 150 -300 kb Чрезвычайно стабильны, 1 -2 копии на клетку Shizuya et al. , 1992 PNAS (USA) 89: 8794 -8797 Другие варианты: PACs (P 1 -derived artificial chromosomes) – в основе бактериофаг Р 1 - емкость до 300 kb. Ioannou et al. , 1994 Nature Genet. 6: 84 -89. Фосмиды (в основе - F-плазмида + участок cos) Kim et al. , 1992. Nucl. Acids Res. 20: 1083 -1085.

Обычные плазмиды могут быть использованы как интеграционные вектора для гомологичесокй рекомбинации in vivo ØТребуется последовательность, которая распознает мишень в геноме хозяина ØГен селективного маркера, который работает в хозяине ØТакой подход используется для бектерий, дрожжей, животной ядерной ДНК и растительного хлоропластного генома. Однако он пока не имел успеха для растительного ядерного генома. Рекомбинация между гомологичными последовательностями Плазмида, несущая вставоную ДНК, окруженную гомологичными участками, схожими с ДНК хозяина Сайт-мишень в геноме хозяина

Важные ферменты, используемые в генных и белковых технологиях Полимеразы ДНК-полимераза РНК-зависимая ДНК-полимераза Нуклеазы Эндогуклеазы рестрикции Экзонуклеазы ДНКазы РНКазы ДНК-лигазы Фосфатазы

Полимеразы ДНК-полимеразы Удлиняют ДНК от 3´-конца путем добавления единиц деоксирибонуклеозид-монофосфатов к свободному концу 3´-OH Требования: цепочка-темплейт ДНК праймер со свободным концом 3´-OH 4 деоксирибонуклеозид трифосфата Используются в ДНК-репликации и репарации Примеры: ДНК-полимераза I Taq-полимераза Применения: ПЦР секвенирование ДНК и т. д. http: //www. learnerstv. com/animation. php? ani=169&cat=biology

РНК-полимеразы удлиняют РНК от 3´конца добавлением единиц деоксирибонуклеозид-монофосфатов к свободному концу 3´-OH праймеры не нужны служат для транскрипции генов применяются для мечения РНК-зондов РНК-зависимая ДНК-полимераза она же обратная транскриптаза использует молекулу РНК как темплейт для синтеза комплиментарной цепочки ДНК требует праймеры обнаруживается в РНК-вирусах (ретровирусах) пример – RTh-полимераза применяется в синтезе к. ДНК и ПЦР

Нуклеазы Это ферменты, которые гидролизуют полинуклеотид. Обычно (но не всегда) оставляя концы 5'-P и 3'-OH. Эндонуклеазы - ферменты, гидролизующие полинуклеотид в середине молекулы Эндонуклеазы рестрикции Это класс бактериальных ферментов, расщепляющих обе цепочки молекулы ДНК в особом месте последовательности. Могут оставлять или тупые или липкие концы. Сайты распознавания различной длины Например, Alu. I режет по 4 bp по CAGT Eco. RI режет по 6 bp по GAATTC Not. I режет по 8 bp по GCGGCCGC

Экзонуклеазы - фермент, который гидролизует концевой остаток полинуклеотида ДНКаза (ДНаза - DNase) - фермент, который гидролизует ДНК неспецифично (т. е. в любом месте молекулы) Используется при очистке РНК для «уничтожения» “contaminating DNA” – «загрязненяющей ДНК» РНКаза (Рназа - RNase) - фермент, который гидролизует РНК Используется при очистке ДНК для деградации РНК Также при клонировании к. ДНК also для конвертирования РНК-ДНК-дуплекса в одноцепочную ДНК (ss. DNA)

ДНК-лигаза - фермент, который «берет» ДНК с открытым фосфатносахарным концом и создает ковалентную связь – «закрывает» молекулу – наиболее наспространенная ДНК-лигаза T 4 (бактериофага), она используется при лигировании и клонировании. cloning) 5’-NNNG-3’ 5’-AATTCNNN-3’ 3’-NNNCTTAA-5’ 3’-GNNN-5’ ДНК-лигаза T 4 5’-NNNGAATTCNNN -3’ 3’-NNNCTTAAGNNN-5’ Фосфатаза - фермент, который удаляет 5’-P из полинуклеотида – например, Calf Intestinal Alkaline Phosphatase используется для обработки линеаризованных плазмид для предотвращения религации

Gateway® - система для рекомбинации in vitro (Invitrogen – фирма-произв. ) Ø Использует ферменты рекомбинации из бактериофага для соединения молекул ДНК вместе по определенным участкам последовательности, называемым сайты att, по которым идет интеграция (встраивания) фага в ДНК E. coli (при формировании профага) ØСайты Att B – этолько 25 bp ØРеакция очень быстрая in vitro (в течение минут) ØНе треуются ферменты рестрикции (рестриктазы) ØЭффективность - 90 -99%, приблизительно каждая плазмида получает вставку ØИспользуется негативная селекция для плазмид без успешной вставки ØЭффективность не зависит от размеров вставки или плазмиды ØМожет быть автоматизирована для массового клонирования генов – например, всех генов генома ØКиты дорогие, поэтому пока используется не часто ØПостоянно появляются новые ферментативные системы Marsischky and La. Baer 2004 для анализа

ØСайты att могут быть введены в любую плазмиду и вставка с полезными (клонируемыми) генами может легко быть передана (если надо) от плазмиды к плазмиде ØВсе происходит in vitro, т. е. без клеток ØОсобенная простота при негативной селекции – только плазмиды со вставкой не разрушаются

ØПервичный вектор ( «входящий» - еntry vector) – в нем ваш ген впервые клонирован (типично это ПЦР-продукт) ØКонечный вектор – это куда вы в конце концов переносите вставку Ø «In vitro-рекомбинация» реализуется смесью ферментов (рекомбиназами), начальная плазмида имеет сайт att. P, конечная сайт att. L, который больше не распознается ферментами и поэтому остается в конечной плазмиде.

Дополнительная литература и ссылки Glick, B. R. & Pasternak, J. J. (1998) ‘Molecular Biotechnology’. Chapter 3 Brown, T. A. (1999) ‘Genomes’ pp 73 -75. Sambrook et al. , (1989) ‘Molecular Cloning’ Chapters 1 -5. Bolivar et al. , 1977 Gene 2: 75 -94. Messing 1983 Meth. Enzymol. 101: 20 -78. Shizuya et al. , 1992 PNAS (USA) 89: 8794 -8797. Ioannou et al. , 1994 Nature Genet. 6: 84 -89. Kim et al. , 1992. Nucl. Acids Res. 20: 1083 -1085. Burke et al. , 1987 Science 236: 806 -812. Hellens et al. , 2000 Trends Plant Science 5: 446 -451 Marsischky and La. Baer 2004 Genome Research 14: 2020 -2028 Vector database Invitrogen vectors Yeast vectors Invitrogen Gateway site (http: //www. invitrogen. com/Content/Online%20 Seminars/gateway/1. htm)