Хозяева (Hosts), векторы и ферменты (основные орудия генной

Хозяева (Hosts), векторы и ферменты (основные орудия генной инженерии) Что такое хозяин? Типы хозяев (хостов) Что такое вектор? Типы векторов Важные ферменты

Типы хозяев  Прокариоты бактерии (& Archaea)  Eukaryotes: Дрожжи Первичные клеточные культуры (животных или растений) Выведенные клеточные линии (животных или растений) Животные Растения Хозяева? Микроорганизм (включая вирусы), также культивируемые клетки или (в некоторых случаях целый организм), который поддерживает клонируемый вектор или ДНК-конструкцию.

Важные бактериальные хозяева: Escherichia coli K12 * & ее формы: XL-1-Blue (TcR) JM105 (recA1) DH5 (recA1) Bacillus subtilis 168 * Agrobacterium tumefaciens * (* геном полностью секвенирован)

Важные дрожжевые хозяева: Saccharomyces cerivisiae S288C * (гаплоидный штамм) D273-10B -меньшее число мутаций в мтДНК Schizosaccharomyces pombe

Животные клеточные культуры и линии: Ткань Ферменты разрушают внеклеточный матрикс Клетки Помещаются в комплексную ростовую среду Образуется монослой (прекращается деление) Субкультивирование (50-100 генераций-поколений) Потеря возможности делиться и прогр. кл. смерть мутация Продолжение деления & неограниченное культивирование и рост Первичные клеточные культуры Клеточная линия

Растения тотипотентны и могут размножаться вегетативно и семенами, все клетки способны к бесконечному росту и делению при определенной гормональной обработке (обычно 1 мМ ауксина + 1 мМ цитокинина)

Что такое вектор? Компоненты базового вектора: Это молекула ДНК, которая способна функционировать внутри клетки хозяина.  Функциональная база репликации  позволяет реплицироваться вектору в клетке хозяина и/или  позволяет интеграцию в ДНК хозяина  Сайты клонирования (рестрикции) желательно уникальные  позволяют встраивать тестируемую ДНК в вектор  Селективные маркеры например, гены устойчивости к антибиотикам или особым ростовым условиям (например, температуре)  это позволяет произвести селекцию клеток хозяина со встроенным вектором

Типы векторов Плазмидные вектора: - общего назначения - с большим кол-вом копий - шатл-веткора (несколько хозяев) - экспрессионные вектора - вектора, несущие пробу промотера - суицидальные вектора (для селекции) Бактериофаговые вектора: - производные фага лямбда - космидные вектора - дрожжевые искусственные хромосомы (YACs) - бактериальные искусственные хромосомы (BACs)

Вектора общего назначения pBR322 (E. coli) Основные характеристики: база репликации ColE1 (oriV) – участок начала репликации элементы: TcR из pSC101 & ApR из Tn3 размер 4.3 kb 20-30 копий на клетку (amplifiable) “уникальные ” сайты рестрикции в участке устойчивости к Антибиотикам  Bolivar et al., 1977 Gene 2:75-94.

Вектора для общих целей клонирования pBR322 (E. coli)

Векторы с большим кол-вом копий A) Векторы pUC (pUC18/19) Основные характеристики:  участок начала репликации из ColE1 (oriV) ген устойчивости к ампицилину АmpR длина 2.7 kb 200-300 копий на клетку MCS - Multi-cloning site – сайт множественного клонирования (в пределах lacZ-гена) отбор (скрининг) по цвету «голубой – белый», благодаря разрыву MCS в lacZ  Messing 1983 Meth. Enzymol. 101:20-78.

Шатл-вектора (с переменным хозяином) В) E. coli - Agrobacterium tumefaciens (бинарные (Bin) вектора) pBIN19 ori из плазмиды RK2 для Agrobacterium и E.coli pGreen – серия плазмид с 2 ori-участками: ColE1 (для E.coli) и pSa (для Agrobacterium) способны реплицироваться в более, чем одном хозяине 2 функциональных начала репликации (ori) клонирование генов может быть произведено в E.coli, а затем перенесено в другого хозяина A) E. coli - Bacillus subtilis Б) E. coli - Saccharyomyces cerevisiae YIp vectors Yeast integrative plasmid vectors YEp vectors Yeast episomal plasmid vectors YCp vectors Yeast centromere plasmid vectors pHB201: pBR322 ori & pTA1060 ori pHV1248: pBR322 ori & pE194 ori

ColEI ori nptI-ген (устойчивости к канамицину) Между левой границей (left border - LB) и правой границей (right border RB) встраиваются гены. Они называются T-ДНК и переносятся в ядро растений. Плазмида pGreen (вектор: E.coli - Agrobacterium – Растение)

Фаговые вектора Исторически являются производными бактериофага лямбда (), сейчас также производные фага P1 Удобны для клонирования фрагментов по 10-15kb (125 kb в P1) ~ 45kb всего может быть упаковано в головку фага Можно устранить гены лизогенного цикла Участки, несущественные для репликации замещаются тестируемой ДНК Имеет т.н. «липкие концы» (когезивные концы) в сайте «cos arms» - 200 bp из них 12 имеют разрезы (устранена фосфогруппа; cosN site) – это обеспечиваюет рециклизацию фага  - липких концах образуется Участок, который легко разрезается и деспиралиуется этот участок Рекомбинантная ДНК упаковывается in vitro в фаговые головки Отбор по пятнам в культуре E. Coli (плак – выемка, пятно)

литический цикл лизогенный цикл

Cos ends (липкие концы) Участок cosN в ДНК фага лямбда: Фермент терминаза разрезает его следующим образом: Образуется одноцепочная ДНК (2 фрагмента – собственно липких конца):

Космиды Это гибридные вектора, содержащие плазмидные и фаговые компоненты Повышает длину колируемого фрагмента до 45 kb (плазмида обычно до 20 kb) Cos ends (липкие концы) фага добавляются к плазмиде Космиды могут существовать как плазмиды in vivo, или быть упакованы в фаговые головки in vitro

Дрожжевые вектора 3 класса:  Эписомальные вектора (дрожжевая эписомальная плазмида YEp) - плазмидные вектора - реплицируются автономно в дрожжах - 2 участка начала репликации (2 ori). - высокое кол-во копий и вероятность трансформации  Интегрированные вектора (интегративные вектора YpI ) - не реплицируются автономно - медленно интегрируются в геном при помощи гомологичной рекомбринации  Yeast artificial chromosomes (искусственная дрожжевая хромосома)

Yeast artificial chromosomes (искусственные дрожжевые хромосомы) Емкость для клонирования от 200 kb до 2 Mb Позволяют физически охарактеризовать большие геномы Состоят из:  ценромер требуются для разъединения хроматид при митозе и мейозе  участок начала репликации: последовательность автономной репликации (autonomous replicating sequence - ARS)  теломеры требуются для полной репликации линейных молекул и защиты от нуклеаз  селективные маркеры (один или более)  по крайней мере один уникальный сайт рестрикции поддерживаются как отдельные стабильные хромосомы в клетках дрожжей  Burke et al., 1987 Science 236:806-812.

pYAC3

Основаны на участке длиной 7kb плазмиды F E. Coli и селекционной системы lacZ’ из плазмиды pUC Размер вставок (ёмкость клонируемой ДНК) – 150-300 kb Чрезвычайно стабильны, 1-2 копии на клетку  Shizuya et al., 1992 PNAS (USA) 89:8794-8797 Другие варианты: PACs (P1-derived artificial chromosomes) – в основе бактериофаг Р1 - емкость до 300kb.  Ioannou et al., 1994 Nature Genet. 6:84-89.  Фосмиды (в основе - F-плазмида + участок  cos)  Kim et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20:1083-1085. Бактериальные искусственные хромосомы (BACs)

Обычные плазмиды могут быть использованы как интеграционные вектора для гомологичесокй рекомбинации in vivo Требуется последовательность, которая распознает мишень в геноме хозяина Ген селективного маркера, который работает в хозяине Такой подход используется для бектерий, дрожжей, животной ядерной ДНК и растительного хлоропластного генома. Однако он пока не имел успеха для растительного ядерного генома. Плазмида, несущая вставоную ДНК, окруженную гомологичными участками, схожими с ДНК хозяина Сайт-мишень в геноме хозяина Рекомбинация между гомологичными последовательностями

Важные ферменты, используемые в генных и белковых технологиях Полимеразы  ДНК-полимераза  РНК-полимераза  РНК-зависимая ДНК-полимераза Нуклеазы  Эндогуклеазы Эндогуклеазы рестрикции  Экзонуклеазы  ДНКазы  РНКазы ДНК-лигазы Фосфатазы

 ДНК-полимеразы Полимеразы http://www.learnerstv.com/animation/animation.php?ani=169&cat=biology Удлиняют ДНК от 3´-конца путем добавления единиц деоксирибонуклеозид-монофосфатов к свободному концу 3´-OH Требования: цепочка-темплейт ДНК праймер со свободным концом 3´-OH 4 деоксирибонуклеозид трифосфата Используются в ДНК-репликации и репарации Примеры: ДНК-полимераза I Taq-полимераза Применения: ПЦР секвенирование ДНК и т.д.

 РНК-полимеразы удлиняют РНК от 3´конца добавлением единиц деоксирибонуклеозид-монофосфатов к свободному концу 3´-OH праймеры не нужны служат для транскрипции генов применяются для мечения РНК-зондов  РНК-зависимая ДНК-полимераза она же обратная транскриптаза использует молекулу РНК как темплейт для синтеза комплиментарной цепочки ДНК требует праймеры обнаруживается в РНК-вирусах (ретровирусах) пример – RTh-полимераза применяется в синтезе кДНК и ПЦР

Нуклеазы  Эндонуклеазы - ферменты, гидролизующие полинуклеотид в середине молекулы  Эндонуклеазы рестрикции Это класс бактериальных ферментов, расщепляющих обе цепочки молекулы ДНК в особом месте последовательности. Могут оставлять или тупые или липкие концы. Сайты распознавания различной длины Например, AluI режет по 4bp по CAGT EcoRI режет по 6bp по GAATTC NotI режет по 8bp по GCGGCCGC Это ферменты, которые гидролизуют полинуклеотид. Обычно (но не всегда) оставляя концы 5'-P и 3'-OH.

 Экзонуклеазы - фермент, который гидролизует концевой остаток полинуклеотида  ДНКаза (ДНаза - DNase) - фермент, который гидролизует ДНК неспецифично (т.е. в любом месте молекулы)  Используется при очистке РНК для «уничтожения» “contaminating DNA” – «загрязненяющей ДНК»  РНКаза (Рназа - RNase) - фермент, который гидролизует РНК  Используется при очистке ДНК для деградации РНК  Также при клонировании кДНК also для конвертирования РНК-ДНК-дуплекса в одноцепочную ДНК (ssDNA)

ДНК-лигаза - фермент, который «берет» ДНК с открытым фосфатно-сахарным концом и создает ковалентную связь – «закрывает» молекулу – наиболее наспространенная ДНК-лигаза T4 (бактериофага), она используется при лигировании и клонировании. cloning) 5’-NNNG-3’ 5’-AATTCNNN-3’ 3’-NNNCTTAA-5’ 3’-GNNN-5’ 5’-NNNGAATTCNNN -3’ 3’-NNNCTTAAGNNN-5’ ДНК-лигаза T4 Фосфатаза - фермент, который удаляет 5’-P из полинуклеотида – например, Calf Intestinal Alkaline Phosphatase используется для обработки линеаризованных плазмид для предотвращения религации

Gateway® - система для рекомбинации in vitro (Invitrogen – фирма-произв.) Использует ферменты рекомбинации из бактериофага l для соединения молекул ДНК вместе по определенным участкам последовательности, называемым сайты att, по которым идет интеграция (встраивания) фага в ДНК E.coli (при формировании профага) Сайты Att B – этолько только 25bp Реакция очень быстрая in vitro (в течение минут) Не треуются ферменты рестрикции (рестриктазы) Эффективность - 90-99%, приблизительно каждая плазмида получает вставку Используется негативная селекция для плазмид без успешной вставки Эффективность не зависит от размеров вставки или плазмиды Может быть автоматизирована для массового клонирования генов – например, всех генов генома Киты дорогие, поэтому пока используется не часто Постоянно появляются новые ферментативные системы  Marsischky and LaBaer 2004 для анализа

Сайты att могут быть введены в любую плазмиду и вставка с полезными (клонируемыми) генами может легко быть передана (если надо) от плазмиды к плазмиде Все происходит in vitro, т.е. без клеток Особенная простота при негативной селекции – только плазмиды со вставкой не разрушаются

Первичный вектор («входящий» - еntry vector) – в нем ваш ген впервые клонирован (типично это ПЦР-продукт) Конечный вектор – это куда вы в конце концов переносите вставку «In vitro-рекомбинация» реализуется смесью ферментов (рекомбиназами), начальная плазмида имеет сайт attP, конечная сайт attL, который больше не распознается ферментами и поэтому остается в конечной плазмиде.

Дополнительная литература и ссылки  Glick, B.R. & Pasternak, J.J. (1998) ‘Molecular Biotechnology’. Chapter 3  Brown, T.A. (1999) ‘Genomes’ pp73-75. Sambrook et al., (1989) ‘Molecular Cloning’ Chapters 1-5.  Bolivar et al., 1977 Gene 2:75-94. Messing 1983 Meth. Enzymol. 101:20-78.  Shizuya et al., 1992 PNAS (USA) 89:8794-8797.  Ioannou et al., 1994 Nature Genet. 6:84-89.  Kim et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20:1083-1085.  Burke et al., 1987 Science 236:806-812.  Hellens et al., 2000 Trends Plant Science 5: 446-451  Marsischky and LaBaer 2004 Genome Research 14: 2020-2028  Vector database  Invitrogen vectors Yeast vectors Invitrogen Gateway site (http://www.invitrogen.com/Content/Online%20Seminars/gateway/1.htm)