Взаимодействие антиген-антитело Методы выявления антигенов в серологических реакциях

Взаимодействие антиген-антитело. Методы выявления антигенов в серологических реакциях.

Взаимодействие антиген-антитело. Феномен и силы взаимодействия Антитела распознают антигены благодаря взаимной комплементарности паратопа и эпитопа. Силы межмолекулярного взаимодействия нарастают при уменьшении расстояния между молекулами антигенов и антител

Взаимодействие антиген-антитело. Феномен и силы взаимодействия 1. Электростатические силы Обусловлены притяжением между противоположно заряженными ионизированными группами, например, аминогруппой (NH 3+) и карбоксильной группой (СОО-) 2. Водородные связи. Образование водородных связей между гидрофильными группами (ОН, NH 2 и СООН) зависит от пространственного сближения молекул. Водородные связи относительно слабы, поскольку имеют чисто электростатическую природу. 3. Гидрофобные взаимодействия. Этот вид взаимодействия может обеспечивать до 50% всего сродства между антигеном и антителом, возникает между гидрофобными группами белков (СН 3, СН 2 и др. ). 4. Вандерваальсовы силы. Это межмолекулярные силы, возникающие в результате взаимодействия внешник электронных облаков

Взаимодействие антиген-антитело. Феномен и силы взаимодействия Аффинность – величина, определяющая прочность взаимодействия между антигеном и одним антиген-связывающим центром антитела. . Если антитела прочно связываются с гаптеном, то такие антитела называют высокоаффинными. Авидность - величина, определяющая прочность связывания поливалентных антигенов с гетерогенной смесью антител.

Взаимодействие антиген-антитело. Феномен и силы взаимодействия Специфичность реакции антиген-антитело. Понятие специфичности реакции антиген-антитело не является абсолютным, оно относительно. Сыворотка, содержащая антитела к одному антигену, может перекрестно реагировать с родственным антигеном, несущим одну или несколько идентичных или похожих антигенных детерминант. Таким образом, каждое антитело может взаимодействовать не только с антигеном вызвавшим его образование, но и с другими, иногда совершенно неродственными молекулами

Биологическая сущность и значимость реакции взаимодействия антиген-антитело Антителозависимые механизмы защиты от патогена Таких механизмов по крайней мере 6: · нейтрализация АТ патогенных свойств Аг самим фактором связывания в комплекс; · элиминация и деструкция комплексов Аг–АТ фагоцитами (нейтрофилами и макрофагами); · деструкция комплексов Аг–АТ активированной системы комплемента; · антителозависимая клеточная цитотоксичность NK и эозинофилов; · сосудистые и гладкомышечные контрактильные реакции, инициируемые комплексом Аг–АТ с «наймом» тучных клеток и базофилов; · реликтовые свойства АТ (собственная протеазная или нуклеазная активность АТ).

Иммунологические методы лабораторной диагностики По сути иммунологическими методами называют такие методы, в которых так или иначе визуализируются реакции антиген-антитело. 1) Методы фракционирования — физического разделения гуморальных факторов иммунитета (молекул) или клеток: - электрофорезы; - проточная микроцитофлюорометрия. 2) Методы, использующие партикулярные (корпускулярные) антигены (непосредственная агглютинация антигенов, гемагглютинация, латекc–агглютинация). 3) Методы, использующие растворимые антигены (реакция преципитации в растворе, геле) 4) Методы, использующие технологию гемолиза (тесты фиксации комплемента). 5) Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная микроскопия). 6) Методы иммуноанализов (радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ). 7) Методы молекулярной биологии (ПЦР; иммуноблоттинг; блот–гибридизация (Southern–blotting определяет ДНК, Northern–blotting определяет РНК)

Реакция преципитации Феномен преципитации – это взаимодействие растворимых антигенов и антител с образованием преципитата (комплекса антиген-антитело). Эта реакция проходит в два этапа: 1) Взаимодействие антигенной детерминанты и комплементарной области антитела; 2) Образование молекулярных комплексов, включающих большое число молекул и антител. Именно эти комплексы воспринимаются визуально как преципитат, проявляющийся изменением прозрачности раствора. Michael Heidelberger, 1950

Реакция преципитации Феномен преципитации широко используется в клинической практике, в частности, в клинике инфекционных болезней. Феномен преципитации лежит в основе многих модифицированных методов, которые могут проводиться либо в растворе, либо в геле. Разновидностью реакции преципитации в растворе является реакция кольцепреципитации в пробирке - реакция относится к качественным методам; - раствор, содержащий антигены, осторожно наслаивают на сыворотку; - реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо преципитата.

Реакция преципитации Методы иммунопреципитации в геле. Основное достоинство – возможность визуального наблюдения преципитата, положение которого в геле совпадает с областью эквивалентности концентраций антигена и антител. Обычно иммунный комплекс в геле начинает формироваться уже спустя несколько минут после контакта антигенов с антителами. Для полной же преципитации необходимо 24 -48 часов (в некоторых случаях до 6 суток), то есть методы иммунопреципитации требуют значительного времени. Методы на основе иммунопреципитации в геле: - Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони - Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини) - Иммуноэлектрофорез

Реакция преципитации Реакция простой радиальной иммунодиффузии (в модификации по Т. Манчини и соавт. , 1965) - Количественный анализ; - Антиген радиально диффундирует из круглой лунки в пластине геля; - Вокруг лунки возникает зона преципитации, ограниченная областью эквивалентности концентраций антигена и антител; - При постоянной концентрации антител в геле имеет место прямая пропорциональность между количеством антигена в лунке и площадью зоны, ограниченной областью преципитации; Зная диаметр зоны преципитации по этой зависимости можно определить концентрацию антигена; - Метод используется для определения концентраций иммуноглобулинов A, M, G, компонентов комплемента, трансферрина, С – реактивного протеина, раково-эмбрионального протеина.

Методы, основанные на реакции агглютинации Феномен агглютинации – это реакция взаимодействия корпускулярного антигена (бактерии, эритроциты, частицы с адсорбированнымина них антигенами) с иммунной сывороткой. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул, «склеенных» антителами. Реакцию агглютинации используют для следующих целей: - определение возбудителя, выделенного от больного; - определение противомикробных и других антител в сыворотке крови больного; - определение группы крови.

Методы, основанные на реакции агглютинации Различают два вида реакции агглютинации: прямая и непрямая. Методы прямой агглютинации. 1. Идентификация возбудителя. Реакция проводится в 2 этапа: - ориентировочная (качественная) реакция на стекле - развернутая реакция агглютинации 2. Определение антител. - клетки инкубируют с двукратными разведениями сыворотки крови больного. - при наличии антител в сыворотке наблюдается агглютинация, активность которой можно выразить величиной конечного титра – последним разведением сыворотки, дающим агглютинацию. - На этом принципе основаны классические реакции Видаля (серодиагностика тифа), реакция Райта (диагностика бруцеллеза). Widal F. , 1910

Методы, основанные на реакции агглютинации 3. К прямым методам агглютинации также можно отнести реакцию агглютинации для определения группы крови системы АВО. Реакция гемагглютинации может проводиться в 2 -х вариантах: 1. С использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток; 2. С использованием моноклональных антител (цоликлонов анти А и анти В).

Методы, основанные на реакции агглютинации Методы непрямой (пассивной) агглютинации. Принцип метода состоит в получении специального типа частиц, на поверхности которых находятся молекулы известной специфичности – антигены (гаптены) или антитела. При наличии в растворе комплементарных структур (соответствующих антител или антигенов), эти частицы образуют агрегаты за счет взаимодействия через такие структуры. Наиболее распространены реакции на основе трех типов агглютинации: - различные варианты пассивной (непрямой) гемагглютинации; - реакция коагглютинации; - реакция латексагглютинации

Методы, основанные на реакции агглютинации Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). - эритроциты с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроциров на дно ячейки в виде фестончатого осадка ( «зонтика» ). При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки» . - РНГА ставят в пластиковых планшетах или пробирках с разведениями сыворотки крови больного к которым добавляют эритроцитарный диагностикум. Отрицательными контролями являются: контроль сыворотки больного на гетерогемагглютинины, контроль на отсутствие спонтанной агглютинации

Методы, основанные на реакции агглютинации Реакция коагглютинации В реакции коагглютинации используется диагностикум в виде фиксированных клеток стафилококка, на поверхности которых адсорбированы антитела, специфичные к определяемому антигену. Связывание антител со стафилококком происходит за счет известного феномена взаимодействия Fc-участков с молекулой протеина А, входящего в состав бактериальных клеток. Реакция латексагглютинации В реакции латексагглютинации используется диагностикум в виде полимерных микрошариков с адсорбированными на них антителами.

Реакция связывания комплемента (РСК) РСК протекает в 2 фазы: 1) взаимодействие антител, антигена и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом антиген — антитело (специфическая фаза); 2) индикация реакции сенсибилизированными эритроцитами (неспецифическая фаза). В РСК используют 2 системы: 1) специфическую, состоящую из антитела (испытуемой сыворотки), антигена и комплемента, 2) неспецифическую, “индикаторную”, содержащую гемолизин (гемолитич. сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. Результаты РСК с сывороткой больного Результаты РСК с сывороткой здорового

Реакция Кумбса Реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса) Антирезусные антитела (Ig. G) взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации ( «неполные» антитела). Наличие таких «неполных» антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулина человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов.

Методы иммуноанализов Иммуноанализами называют такие методы качественного и количественного определения растворимых веществ, в основе которых лежит взаимодействие антигена с антителом (т. е. иммунологическое распознавание), которое детектируется (визуализуется) с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с антителом (моноклональные антитела), либо с антигеном. В качестве меток используют вещества, которые при определённых условиях может увидеть либо тот или иной прибор, либо глаз человека. 1 - антиген 2 - антитело 3 - метка МЕТКИ: 1) радионуклид, анализ называют радиоиммунным (РИА); 2) ферменты, катализирующие превращение субстрата с образованием цветного или флюоресцирующего продукта. В данном случае анализы называют иммуноферментными (ИФА) или, как разновидность, иммунофлюоресцентными; 3) флюоресцирующие или люминесцирующие вещества и др.

Моноклональные антитела (методика получения)

Иммунофлюоресцентные методы Примеры иммунофлюоресцентных исследований: Флюоресценция бактериальных клеток Флюоресцентный микроскоп Иммунофлюоресценция нейронов и астроцитов

Иммуноферментный анализ Первые разработки иммуноанализов были в так называемых гомогенных вариантах, или без разделения компонентов, т. е. в растворе. Но вскоре стали использовать твёрдую фазу, анализы стали называть твёрдофазными, или с разделением компонентов, или иммуносорбентными (ELISA — Enzyme–Linked Immuno. Sorbent Assay). Технологически твёрдофазные анализы несравнимо удобнее гомогенных, и в настоящее время применяют только твёрдофазные варианты методик ИФА. На твёрдую фазу сорбируют либо антиген, либо антитело. В качестве «твердой фазы» используют следующие материалы: 1) Пластмассу (полистиролы, поливинилхлориды) в виде стандартно штампованных микропанелей с 96 или 60 лунками); 2) пористые материалы типа нитроцеллюлозы В качестве ферментов–меток в ИФА используют следующие ферменты: 1) пероксидазу из корней хрена; 2) b–галактозидазу; 3) уреазу

Иммуноферментный анализ ИФА: определение антител в сыворотке крови больного (в лунках планшетов с адсорбированным антигеном) Набор реагентов для проведения ИФА

Возможности использования коммерческих препаратов для различных методов лабораторной диагностики при инфекциях человека Метод Определяемый компонент Инфекционная патология (возбудитель) Прямая агглютинация Антигены, антитела Кишечная инфекция (Salmonella, Shigella, Proteus), респираторная инфекция (B. pertussis, Legionella, S. pneumoniae и др. ) Преципитация Антигены, антитела Гистоплазмоз, аспергиллез, кандидоз, сифилис, стрептококковая инфекция РПГА Антитела Yersinia, Staphylococcus, мононуклеоз, краснуха, эхинококкоз, амебная дизентерия Реакция связывания комплемента Антитела Большинство патогенных вирусов, хламидийная и микоплазменная инфекции, риккетсиозы. Иммунофлюоресценция Антитела, антигены Аденовирусы, вирусы ECHO- коксаки, цитомегаловирус, большинство патогенных бактерий Иммуноферментный анализ Антигены, антитела Большинство патогенных бактерий, вирусов, грибов, простейших