Высокоразрешающая микроскопия при изучении макромолекул клеток и других

Высокоразрешающая микроскопия при изучении макромолекул, клеток и других структур.

l Цель: ознакомиться с особенностями высокоразрешающей микроскопии клеток и других структур. l В конце концов, как бы ни хотелось миниатюризировать и миниатюризировать, приходит день, когда кусочек вещества становится слишком уж маленьким, чтобы втиснуть в него приборчик и тем более машину. . . В 1960 -х годах думали, что миниатюризация наткнется на естественный предел тогда, когда выйдет на размеры молекул живого вещества – а это белки или ДНК, молекулы из тысяч атомов. Как раз в то время узнали о способности макромолекул накапливать информацию, транспортировать другие молекулы, вырабатывать энергию и общаться между собой. Впервые изображение одиночной молекулы было получено в 1957 году, на электронном микроскопе. Но туннельный микроскоп, изобретенный в 1981 году, позволил не только вывести на экран изображение одной молекулы, но и прикоснуться к этой молекуле иглой микроскопа. l

l l l Независимость молекулы, то есть ее существование в качестве самостоятельной материальной сущности, превратилась из умозрительного представления в факт, который можно использовать. С тех пор, собственно, и началось приключение по имени нанотехнология. Это она позволяет создавать устройства много меньших размеров, чем все то, что изготавливалось до сих пор: речь о приборах величиной порядка нанометра и допусках точности в десятые доли нанометра. Прикосновение иглы туннельного микроскопа к молекуле превращает ее в самую малюсенькую машину из всех, какие только возможны. Однако с самого начала понятие молекулы предлагалось как ответ на задачу определения веществ. По определению, молекула есть самая маленькая частица соответствующего вещества. В XIX веке наука о материи продвигалась вперед так успешно, как никогда ранее. Англичанин Джон Дальтон догадался, что вещество состоит из атомов с разными массами и атомы объединяются в молекулы – так в первый раз прозвучало правильное описание материи.

l l Однако на протяжении всего XIX века химиков сильно смущала одна загадка, с которой они то и дело сталкивались: некоторые вещества, состоявшие из, казалось бы, одинаковых молекул, выказывали совершенно разные свойства. Но вот незадача: никто никогда не видел ни единой молекулы – уж слишком они малы, настолько, что ни в один микроскоп не углядишь. Так что по большому счету молекула оставалась гипотезой, и немало ученых людей, в том числе и самых прославленных, отказывались признавать саму концепцию молекулы. В 1947 году американский биохимик Альберт Сент. Дьёрдьи предположил, что белки заставляют электрон двигаться вдоль своего атомного каркаса, примерно так, как это происходит в электрическом проводе. Американский физикохимик Генри Таубе вспомнил идею Сент-Дьёрдьи и, чтобы ее проверить, поставил ряд экспериментов. К концу 1950 х годов он придумал и синтезировал продолговатые молекулы (около 1 нм в длину и диаметром 0, 2 нм). Затем он исследовал их методами спектроскопии: пропустив луч света через объем раствора, содержащий миллиарды таких молекул, он обнаружил такое поглощение инфракрасного излучения, которое можно было объяснить только какими-то межмолекулярными взаимодействиями.

l l Таубе показал, что энергия поглощенного излучения связана с перемещением, или передачей электрона из одного места молекулы в другое. Тем самым он получил доказательства того, что электроны способны двигаться по молекуле по одному и один за другим – почти так же, как по электрическому проводу. Впервые удалось придумать и создать молекулу, в которой электроны могли перемещаться с одного ее края до противоположного. В 1989 году Дональд Эйглер захотел построить микроскоп, работающий на основе туннельного эффекта, чтобы поглядеть, как такой редкий газ, как ксенон, взаимодействует с металлической поверхностью. На это у него ушло три года. Когда же микроскоп был готов, Эйглер, вместо того чтобы проецировать на поверхность металла пучок атомов ксенона, разместил эти атомы на поверхности и стал наблюдать за ними и за их взаимодействием с металлической подложкой. Такие редкие газы, как ксенон, называются благородными потому, что они очень устойчивы и при этом практически не вступают в химические реакции с атомами иных элементов. Чтобы атомы ксенона не сбежали с подложки, Дон Эйглер охладил ее до очень низкой температуры.

l И вот однажды ночью (когда вибрации здания минимальны — и сотрудники ушли домой, и машины за окном уже не ездят) он увидел изображения – сначала одних атомов, а потом и других и на одном и том же участке металлической поверхности. И хоть иголка микроскопа все равно болталась, всякий раз магнитоскоп после очередного колебания иглы регистрировал новый образ. Затем Эйглер, изучая зарегистрированные изображения, придал потоку изображений большую скорость (это примерно так, как если смотреть кино на повышенной скорости смены кадров) и заметил, что одно изображение атомов «перетекает» в другое и что направление перетекания совпадает с направлением отклонения иглы. Он повторил опыт и увидел, что в зависимости от напряжения, приложенного к игле, и тока, через нее протекающего, изображение получается или тривиальным, не обнаруживающим ничего особенного, или измененным – с шевелящимися атомами. Дон Эйглер

l Итак, налицо доказательства того, что не бессонная ночь повинна в смещении атомов. Их движение – не игра случая, но результат усилий экспериментатора. Получается, что атомами можно манипулировать – вопреки всякому ожиданию и наперекор всем квантовым предписаниям. Чтобы доказать свою правоту, Дон Эйглер написал слово «IBM» , выложив буквы 35 атомами ксенона. Эта картинка облетела весь мир и ознаменовала рождение нанотехнологии: человек заставил атомы «ходить строем» . Дон Эйглер, что и говорить, первопроходец, но его удача породила новые вопросы. Например: а нельзя ли перемещать одиночные большие молекулы? Иголка может «наступить» не только на атом, но и на молекулу, и та схватится за кончик иглы. Но в молекуле, особенно огромной, и атомов много, и энергия захвата рассеется на многочисленных химических связях между атомами внутри молекулы. В итоге молекула не сдвинется, а то и слетит с иглы – если экспериментатор надавит на молекулу чуть посильнее.

l Туннельный микроскоп формирует изображение, пользуясь облачками электронов, окружающих атомы, а не непосредственно самими атомами. Сигнал микроскопа столь силен, что электронное облако становится совсем прозрачным для «туннельных» электронов, испускаемых микроскопом. Можно составить карту этой прозрачности, которая пропорциональна электропроводимости туннельного соединения «игла–молекула–поверхность» . Нельзя сказать, чтобы такая карта разом становилась бы полноценным изображением – этакой «фотокарточкой молекулы» . Нередко карта получалась трудночитаемой, и было непросто понять, что же изображено на картинке, и догадаться, какова форма молекулы; да и сообразить, молекула ли это или какие-то помехи, удавалось не всегда. Принцип работы сканирующе-го туннельного микроскопа (СТМ).

l Сканирующие микроскопы представляют собой группу уникальных по своим возможностям приборов. Они позволяют достигать увеличения достаточного, чтобы рассмотреть отдельные молекулы и атомы. При этом возможно изучать объекты, не разрушая их и, даже, что особенно важно с точки зрения медикобиологических применений, в некоторых случаях изучать живые объекты. Сканирующие микроскопы некоторых типов позволяют также манипулировать отдельными молекулами и атомами. Уникальные возможности сканирующих микроскопов определяют перспективы их применения в медико-биологических исследованиях. Это в первую очередь изучение молекулярной структуры клеточных мембран.

l Электронная микроскопия – совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др. ) с помощью электронных микроскопов (ЭМ) – приборов, в которых для получения увеличенных изображений используют электронный пучок. Электронная микроскопия включает также методики подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа результирующей информации. Различают два главных направления электронной микроскопии: трансмиссионную (просвечивающую) и растровую (сканирующую), основанных на использовании соответствующих типов ЭМ. Они дают качественно различную информацию об объекте исследования и часто применяются совместно. Известны также отражательная, эмиссионная, оже-электронная, лоренцова и иные виды электронной микроскопии, реализуемые, как правило, с помощью приставок к трансмиссионным и растровым ЭМ.

l Электронный луч – направленный пучок ускоренных электронов, применяемый для просвечивания образцов или возбуждения в них вторичных излучений (например, рентгеновского). Ускоряющее напряжение – напряжение между электродами электронной пушки, определяющее кинетическую энергию электронного луча. Разрешающая способность (разрешение) – наименьшее расстояние между двумя элементами микроструктуры, видимыми на изображении раздельно (зависит от характеристик ЭМ, режима работы и свойств образцов). Светлопольное изображение – увеличенное изображение микроструктуры, сформированное электронами, прошедшими через объект с малыми энергетическими потерями (структура изображается на экране электроннолучевой трубки (ЭЛТ) темными линиями и пятнами на светлом фоне). Темнопольное изображение формируется рассеянными электронами (основной пучок электронов при этом отклоняют или экранируют) и используется при изучении сильнорассеивающих объектов (например, кристаллов); по сравнению со светлопольным выглядит как негативное.

l Хроматическая аберрация – снижение скорости электронов после просвечивания объекта, приводящее к ухудшению разрешения; усиливается с увеличением толщины объекта и уменьшением ускоряющего напряжения. Контрастирование (химическое и физическое) – обработка исследуемых образцов для повышения общего контраста изображения и (или) выявления отдельных элементов их структуры. Оттенение – физическое контрастирование микрочастиц, макромолекул, вирусов, состоящее в том, что на образец в вакуумной установке напыляется тонкая пленка металла. при этом "тени" (ненапыленные участки) прорисовывают контуры частиц и позволяют измерять их высоту. Негативное контрастирование – обработка микрочастиц или макромолекул на пленкеподложке растворами соединений тяжелых металлов (U и др. ), в результате чего частицы будут видны как светлые пятна на темном фоне (в отличие от позитивного контрастирования, делающего темными сами частицы).

l Ультрамикротом (ультратом) – прибор для получения ультратонких (0, 01 -0, 1 мкм) срезов объектов с помощью стеклянных или алмазных ножей. Реплика – тонкая, прозрачная для электронов пленка из полимерного материала либо аморфного углерода. повторяющая микрорельеф массивного обьекта или его скола. Сканирование – последовательное облучение изучаемой поверхности узким электронным лучом-зондом с помощью развертки (в трансмиссионных приборах все поле зрения облучается одномоментно). Развертка – периодическое отклонение электронного луча по осям X и Y с целью формирования электронного растра. Растр – система линий сканирования на поверхности образца и на экране ЭЛТ.

l Трансмиссионная микроскопия реализуется с помощью трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопов, в которых тонкопленочный объект просвечивается пучком ускоренных электронов с энергией 50– 200 кэ. В. Электроны, отклоненные атомами объекта на малые углы и прошедшие сквозь него с небольшими энергетическими потерями, попадают в систему магнитных линз, которые формируют на люминесцентном экране (и на фотопленке) светлопольное изображение внутренней структуры. При этом удается достичь разрешения порядка 0, 1 нм, что соответствует увеличениям до 1, 5 х106 раз. Рассеянные электроны задерживаются диафрагмами, от диаметра которых в значительной степени зависит контраст изображения. При изучении сильнорассеивающих объектов более информативны темнопольные изображения.

l Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. При исследовании тонких пленок и срезов полимерных материалов и биологических тканей контраст возрастает пропорционально их толщине, но одновременно снижается разрешение. Поэтому применяют очень тонкие (не более 0, 01 мкм) пленки и срезы, повышая их контраст обработкой соединениями тяжелых металлов, которые избирательно взаимодействуют с компонентами микроструктуры (химическое контрастирование). Ультратонкие срезы полимерных материалов (10 -100 нм) получают с помощью ультрамикротомов, а пористые и волокнистые материалы предварительно пропитывают и заливают в эпоксидные компаунды. Металлы исследуют в виде получаемой химическим или ионным травлением ультратонкой фольги. Для изучения формы и размеров микрочастиц (микрокристаллы, аэрозоли, вирусы, макромолекулы) их наносят в виде суспензий либо аэрозолей на пленки-подложки из формвара (поливинилформаль) или аморфного С, проницаемые для электронного луча, и контрастируют методом оттенения или негативного контрастирования.

l l l Для анализа металлической фольги, а также толстых (1 -3 мкм) срезов др. материалов используют высоко- и сверхвысоковольтные. Это позволяет снизить энергетические потери электронов при просвечивании образцов и получить четкие изображения, свободные от хроматической аберрации. Структура гелей, суспензий, эмульсий и биологических тканей с большим содержанием воды может быть исследована методами криорепликации: образцы подвергают сверхбыстрому замораживанию и помещают в вакуумную установку, где производится раскалывание объекта и осаждение на поверхность свежего скола пленки аморфного С и оттеняющего металла. Полученная реплика, повторяющая микрорельеф поверхности скола, анализируется в ТЭМ. Разработаны также методы, позволяющие делать ультратонкие срезы замороженных объектов и переносить их, не размораживая, в ТЭМ на криостолик, сохраняющий температуру объекта в ходе наблюдения на уровне -150 °С (криоультратомия и криомикроскопия). ТЭМ обеспечивает также получение дифракционных картин (электронограмм), позволяющих судить о кристаллической структуре объектов и точно измерять параметры кристаллических решеток. Всочетании с непосредственными наблюдениями кристаллических решеток в высокоразрешающих ТЭМ данный метод - одно из основных средств исследования ультратонкой структуры твердого тела.

l Растровая (сканирующая) микроскопия. В растровых электронных микроскопах (РЭМ) электронный луч, сжатый магнитными линзами в тонкий (1 -10 нм) зонд, сканирует поверхность образца, формируя на ней растр из нескольких тысяч параллельных линий. Возникающее при электронной бомбардировке поверхности вторичные излучения (вторичная эмиссия электронов, ожеэлектронная эмиссия и др. ) регистрируются различными детекторами и преобразуются в видеосигналы, модулирующие электронный луч в ЭЛТ. Развертки лучей в колонне РЭМ и в ЭЛТ синхронны, поэтому на экране ЭЛТ появляется изображение, представляющее собой картину распределения интенсивности одного из вторичных излучений по сканируемой площади объекта. Увеличение РЭМ определяется как М = L/l, где L и l - длины линий сканирования на экране ЭЛТ и на поверхности образца. Колонна микроскопа Камера с детекторами и столиком образцов Компьютер и монитор

l l Выбор регистрируемого вторичного излучения обусловлен задачей исследования. Основной режим работы РЭМ – регистрация вторичных электронов (ВЭ). Поскольку интенсивность эмиссии ВЭ сильно зависит от угла падения электронного луча на поверхность, получаемое изображение весьма близко к обычному макроскопическому изображению рельефа объекта, освещаемого со всех сторон рассеянным светом; иначе говоря, формируется топографический контраст. Эмиссия ВЭ отличается наибольшей интенсивностью по сравнению с другими вторичными излучениями. Кроме того, в этом При исследовании неоднородных по составу поверхностей на топографическое изображение ВЭ накладывается дополнительное распределение яркостей, зависящее от среднего атомного номера Z вещества образца на каждом микроучастке (так называемый композиционный, или Zконтраст), который проявляется сильнее, если регистрировать не вторичные, а упругорассеянные электроны. Этот режим применяют при исследовании шлифов металлических сплавов минералов, композиционных материалов и других объектов, когда топографический контраст отсутствует и нужно установить композиционную неоднородность поверхности.

Качество изображения в РЭМ зависит от параметров электронного пучка - размера пучка - угла апертуры - тока пучка (зонда) - I - ускоряющие напряжение - U. - рабочее (фокусное) расстояние - WD Полюсной наконечник Электронный пучок (зонд) Образец Рабочее расстояние

l l l Тонкопленочные образцы (до 1 мкм) просвечиваются электронным лучом насквозь и прошедшие электроны регистрируются детектором, расположенным под объектом. Изображения, получаемые в этом режиме, иногда более информативны, чем обычные ТЭМ-изображения, т. к. свободны от хроматической аберрации. В технических исследованиях используется также регистрация поглощенных электронов в сочетании с приложением рабочих напряжений к изучаемому транзистору или интегральной схеме. Это позволяет получать изображение, отвечающее распределению электрических потенциалов, и таким образом выявлять микродефекты в элементах схемы. При этом можно прерывать первичный электронный луч с высокой частотой и визуализировать прохождение по схеме высокочастотных сигналов. С помощью соответствующих детекторных систем и спектрометров в РЭМ можно регистрировать электромагнитные излучения: катодолюминесценцию, тормозное и характеристические рентгеновские излучения, а также ожеэлектроны. Получаемые при этом изображения и спектры дают количеств, информацию о локальном элементном составе поверхностных слоев образца и широко применяются в материаловедении.

l Для изучения структуры поверхности посредством РЭМ к образцу предъявляется ряд требований. Прежде всего, его поверхность должна быть электропроводящей, чтобы исключить помехи за счет накопления поверхностного заряда при сканировании. Кроме того, нужно всемерно повышать отношение сигнал/шум, которое наряду с параметрами оптической системы определяет разрешение. Поэтому перед исследованием на диэлектрические поверхности путем вакуумного испарения или ионного распыления наносят тонкую (15 -20 нм) однородную пленку металла с высоким коэффициентом вторичной электронной эмиссии (Au, Au-Pd, Pt. Pd). Биологические объекты, содержащие, как правило, большое количество воды, перед нанесением покрытия необходимо зафиксировать специальной химической обработкой и высушить, сохранив естественный микрорельеф поверхности (сушка в критической точке с использованием сжиженных СО 2 и N 2 O, хладонов или вакуумнокриогенными методами).

l l Разрешающая способность РЭМ определяется многими факторами, зависящими как от конструкции прибора, так и от природы исследуемого объекта. Если образец электро- и теплопроводен, однороден по составу и не обладает приповерхностной пористостью, в РЭМ с вольфрамовыми электродами достигается разрешение 5 -7 нм, в РЭМ с электронными пушками на полевой эмиссии - 1, 0 -1, 5 нм. Перспективные направления развития. К ним относятся: повышение разрешающей способности ТЭМ и РЭМ; совершенствование способов подготовки образцов; разработка методов получения качественно новой информации и повышения чувствительности методов анализа с помощью спектрометрических систем; разработка методов компьютерной обработки полученных изображений с целью выявления содержащейся в них количественной информации о структуре объекта; автоматизация и компьютеризация ТЭМ, РЭМ и соединенной с ними аналитической аппаратуры. Формирование растрового изображения точечное (растровое) изображение сканируемого объекта, иногда называют растром каждая точка растра имеет единственно соответствующую ей точку изображения

l l Повышение разрешающей способности микроскопов достигается главным образом совершенствованием электронной оптики и применением новых видов электронных пушек. Замена традиционных вольфрамовых термокатодов на ориентир, катоды из La. B 6 позволила повысить электронную яркость пушек в 5 -7 раз, а переход к пушкам на полевой эмиссии (автоэмиссии) с холодными катодами из монокристаллического W - в 50 -100 раз, что дало возможность уменьшить диаметр электронного зонда и довести разрешение РЭМ до 1 нм, существенно снизив при этом лучевую нагрузку на образец. Развитие способов подготовки образцов наиболее активно происходит в области электронно-микроскопического исследования структуры полимерных материалов и влагосодержащих объектов и связано преимущественно с разработкой криогенных методов (сверхбыстрое замораживание в струе хладона, прижим к металлическому блоку, охлаждаемому жидким Не, низкотемпературное замещение воды органическими растворителями, криоультратомия, криомикроскопия и др. ). Эти методы позволяют избежать нарушений структуры и локального состава образцов, наблюдаемых при химической фиксации и нанесении электропроводных покрытий.

l l Такая же цель достигается и при использовании низковакуумного растрового электронного микроскопа (НВРЭМ), дающего возможность исследовать поверхность сильно увлажненных и даже живых объектов без предварительной химической или криогенной фиксации. В НВРЭМ объектная камера отделена от колонны РЭМ диафрагмой малого диаметра, пропускающей сканирующий электронный луч, но препятствующей проходу молекул газов в высоковакуумную часть колонны. Испускаемые поверхностью ВЭ собираются специальным кольцевым детектором, охватывающим объект. Использование НВРЭМ значительно расширяет исследовательские возможности биологов, почвоведов и материаловедов, позволяя в перспективе создать "полевой" вариант РЭМ. Мощный прорыв в трансмиссионной электронной микроскопии был сделан в 1980 -х гг. , когда удалось создать ТЭМ с компьютерным анализатором элементного состава на базе спектрометра энергетических потерь. Метод спектрометрии энергетических потерь электронов (EELS - Electron Energy Loss Spectrometry) был известен давно и применялся для микроанализа в трансмиссионно-сканирующем режиме ТЭМ.

l l Однако установка спектрометрической системы из двух магнитных призм и электростатического зеркала между двумя промежуточными линзами (а не под экраном и фотокамерой, как обычно) дала возможность гибко регулировать контраст ТЭМизображения, получать безаберрационные изображения толстых (до 1 мкм) срезов, а главное, получить элементноселективные изображения в диапазоне элементов от В до U с разрешением порядка 0, 5 нм и чувствительностью обнаружения до 10 -20 г элемента (что соответствует, например, 150 атомам Са). Такое сочетание характеристик создает большие преимущества электронной микроскопии перед традиционными методами рентгеноспектрального микроанализа при изучении срезов и пленок. Развитие компьютерной техники обусловило значительный прогресс в области математической обработки электронных изображений (компьютерная морфометрия).

l Разработанные аппаратно-программные комплексы позволяют: запоминать изображения, корректировать их контраст; расширять диапазон яркостей путем введения условных цветов; устранять шумы; подчеркивать границы микроучастков, выделять детали микроструктуры в заданном диапазоне размеров и оптической плотности; проводить статистическую обработку изображений и строить гистограммы распределения микрочастиц по размерам, форме и ориентации; реконструировать объемные изображения структуры композиционных материалов и иных объектов по микрофотографиям серийных срезов; реконструировать объемные изображения микрорельефа и строить профилограммы сечений по стереомикрофотографиям; рассчитывать локальные микроконцентрации элементов по элементно-селективным изображениям и спектрам; определять параметры кристаллич. решеток по электронограммам и др. Кроме того, встроенные в ТЭМ и РЭМ процессоры позволяют гибко управлять микроскопами, значительно снижают электроннолучевое повреждение образцов, повышают достоверность и воспроизводимость результатов анализа микроструктуры, облегчают труд исследователей.