Скачать презентацию Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ HPLC high performance Скачать презентацию Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ HPLC high performance

ВЭЖХ-long.ppt

  • Количество слайдов: 38

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) HPLC – high performance liquid chromatography or HPLC – high Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) HPLC – high performance liquid chromatography or HPLC – high pressure liquid chromatography or HPLC – high price liquid chromatography Это хроматография, в которой подвижная фаза - жидкость. Неподвижной фазой (НЖФ) является неорганический адсобент или органическое твердое вещество, ковалентно связанное с частицами сорбента в колонке.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) По сути -это колоночная жидкостная хроматография, в которой применение современного Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) По сути -это колоночная жидкостная хроматография, в которой применение современного оборудования позволило достичь высоких скоростей и высокой эффективности разделения. 70 -е годы - гигантский прогресс в инструментальной базе явился основой для современной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФ

ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ А-02» ПРОГРАММИРОВАНИЕ: ü Температуры ü Скорости потока ü Объема вводимой пробы ü ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ А-02» ПРОГРАММИРОВАНИЕ: ü Температуры ü Скорости потока ü Объема вводимой пробы ü Продолжительности анализа ü Состава элюента ü Режима элюирования (изократический или градиентный) ü Формы градиента (в градиентном режиме) ü Режима работы детектора

ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ А-02» ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ А-02»

Принцип «Подобное растворяется в подобном; а разделяется противоположным» работает и в ВЭЖХ Элюция – Принцип «Подобное растворяется в подобном; а разделяется противоположным» работает и в ВЭЖХ Элюция – процесс прохождения веществ через колонку с потоком подвижной фазы Элюат – выходящий из колонки поток подвижной фазы с компонентами разделяемой смеси Элюент – растворитель (или смесь), использующийся в качестве подвижной фазы Элюирующая сила – способность подвижной фазы (смеси растворителей) десорбировать и вымывать компоненты пробы с сорбента данного типа Элюотропный ряд – ряд, в котором растворители расположены в порядке возрастания элюирующей силы

Область применения ВЭЖХ 1. Углеводороды и их заместители: Алканы и алкены, бензолы, многоядерные ароматические, Область применения ВЭЖХ 1. Углеводороды и их заместители: Алканы и алкены, бензолы, многоядерные ароматические, гетероциклы 2. Биоорганические соединения: Углеводы, сложные липиды, гормоны, органические кислоты, пептиды, витамины, пигменты, ПАВ 3. Биоорганические соединения: Белки, ДНК, РНК 4. Полимеры, их моно- и олигомеры 5. Ионы: неорганические и органические

Классификация жидкостной хроматографии По характеристикам и взаимодействиям неподвижной фазы: Нормально-фазная Обращенно-фазная Ионообменная Эксклюзионная Классификация жидкостной хроматографии По характеристикам и взаимодействиям неподвижной фазы: Нормально-фазная Обращенно-фазная Ионообменная Эксклюзионная

Неподвижные фазы Нормально-фазная жидкостная хроматография: неподвижная фаза – полярная (силикагель), подвижная фаза – неполярная. Неподвижные фазы Нормально-фазная жидкостная хроматография: неподвижная фаза – полярная (силикагель), подвижная фаза – неполярная. Элюенты: углеводороды, эфиры

Неподвижные фазы Обращенно-фазная жидкостная хроматография : неподвижная фаза – неполярная (модифицированный силикагель), подвижная фаза Неподвижные фазы Обращенно-фазная жидкостная хроматография : неподвижная фаза – неполярная (модифицированный силикагель), подвижная фаза – полярная. Элюенты: спирты, нитрилы, вода

Выход веществ с разной полярностью на разных фазах Нормальная фаза Обращенная фаза Слабополярный элюент Выход веществ с разной полярностью на разных фазах Нормальная фаза Обращенная фаза Слабополярный элюент Сильнополярный элюент Среднеполярный элюент Полярность веществ: A > B > C

Неподвижные фазы Неподвижная фаза в ионообменной хроматографии имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с Неподвижные фазы Неподвижная фаза в ионообменной хроматографии имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Группы привиты на полимер или силикагель. Может быть двух типов — катионной и анионной. Катионит: делит катионы Элюенты: водные растворы солей, кислот, щелочей Анионит: делит анионы

Неподвижные фазы Эксклюзионная или гель-проникающая хроматография Сорбенты: макропористые стекла, полистирол, имеющие выраженную поровую систему Неподвижные фазы Эксклюзионная или гель-проникающая хроматография Сорбенты: макропористые стекла, полистирол, имеющие выраженную поровую систему Звено полистирола (поливинилбензола) Область применения: анализ полимеров по молекулярному весу молекул.

КОЛОНКА – «СЕРДЦЕ» ХРОМАТОГРАФА Успех разделения в ВЭЖХ во многом зависит от типа сорбента КОЛОНКА – «СЕРДЦЕ» ХРОМАТОГРАФА Успех разделения в ВЭЖХ во многом зависит от типа сорбента и качества упаковки им колонки. «Идеальная» частица адсорбента с порами Реальные частицы адсорбента, заполняющие колонку

КОЛОНКА – «СЕРДЦЕ» ХРОМАТОГРАФА КОЛОНКА – «СЕРДЦЕ» ХРОМАТОГРАФА

Колонки для ВЭЖХ Длина Вн. диаметр Размер частиц Число т. т. 5 – 30 Колонки для ВЭЖХ Длина Вн. диаметр Размер частиц Число т. т. 5 – 30 см 2 - 8 мм 3 – 10 ± 1 мкм 5000 - 12000

Колонки для ВЭЖХ • Имеют указатель направления потока, который не следует менять • Внутренняя Колонки для ВЭЖХ • Имеют указатель направления потока, который не следует менять • Внутренняя поверхность – гладкий металл • Плавный переход от большего внутреннего диаметра к малому внешнему диаметру (под штуцер) • Фильтры с диаметром пор 2 -5 мкм на входе и выходе • Возможно использование предколонки меньшей длины

Выбор состава элюента: свойства разделяемых веществ, свойства неподвижной фазы Вязкость жидкостей при 25 °C, Выбор состава элюента: свойства разделяемых веществ, свойства неподвижной фазы Вязкость жидкостей при 25 °C, [м. Па·с] ацетон 0. 31 бензол 0. 60 кровь (при 37 °C) 3– 4 касторовое масло 985 этиловый спирт 1. 07 этиленгликоль 16. 1 üИндекс рефракции глицерин (при 20 °C) 1490 üЭлюирующая сила мазут 2022 ртуть 1. 53 üТип взаимодействия метиловый спирт 0. 54 жидкий азот (при 77 K) 0. 16 ü Чистота пропанол 1. 95 оливковое масло 81 серная кислота 24. 2 вода 0. 89 У элюентов важны свойства: м. Па·с üВязкость üПрозрачность в УФ-диапазоне % Et. OH в водной смеси ü Смешиваемость

Свойства элюентов: смешиваемость Не смешиваются Смешиваются Кс ил о л эф пт ир Ге Свойства элюентов: смешиваемость Не смешиваются Смешиваются Кс ил о л эф пт ир Ге ан М ет кса ан н ол M E Из K ок т Из Пен ан о п та р Ди опа н н пр оп ол ил C э 2 H ф и TH 2 C l р F 4 То Тр л их уо ло л эт Во ан да Ге ти л л р Ци оге м кл кса Ди опе н хл нт оэ ан т су Ук CH ан 2 D M Cl F 2 DM S Ди O н окс Эт а и Эт л ац а е Ди нол тат э Изопропанол – хороший промежуточный растворитель сн а Ац я Ац ето е н Бе тон нз итр Бу ол ил та Те нол тр Хл ахл о о Ци роф рид к о Название Уксусная кислота Ацетонитрил Бензол Бутанол Тетрахлорид углерода Хлороформ Циклогексан Циклопентан Дихлорэтан Дихлорметан Диметилформамид Диметил сульфоксид Диоксан Этил ацетат Этанол Диэтиловый эфир Гептан Гексан Метанол Метилэтил кетон Изооктан Пентан Изопропанол Дипропиловый эфир Тетрахлорэтан Тетрагидрофуран Толуол Трихлороэтан Вода Ксилол

Свойства элюентов: элюирующая сила Элюирующая сила – способность элюента вытеснять адсобированные анализируемые вещества в Свойства элюентов: элюирующая сила Элюирующая сила – способность элюента вытеснять адсобированные анализируемые вещества в поверхности адсорбента, Растворитель Гексан Бензол Бутилхлорид Хлороформ Дихлорметан Изопропиловый эфир Этилацетат Тетрагидрофуран Ацетонитрил Метанол , для силикагеля 0. 01 0. 10 0. 26 0. 32 0. 34 0. 38 0. 44 0. 50 0. 70

Компоненты ВЭЖХ прибора: Система подачи элюентов üФильтрация üДегазация üСмешивание üКонтроль давления (50 -200 атм) Компоненты ВЭЖХ прибора: Система подачи элюентов üФильтрация üДегазация üСмешивание üКонтроль давления (50 -200 атм)

Насосы Требования: • Изготовление из материалов, инертных к растворителям • Доставка растворителей с отн. Насосы Требования: • Изготовление из материалов, инертных к растворителям • Доставка растворителей с отн. высокими скоростями до 10 мл/мин • Точность скорости потока (<0. 5% вариации), без пульсов • Обеспечение высокого давления (до 200 атм) • Низкий объем жидкости в головке • Надежность

Насосы Шприцевого типа - Постоянная скорость потока - Отсутствие пульсов - Низкие скорости потока Насосы Шприцевого типа - Постоянная скорость потока - Отсутствие пульсов - Низкие скорости потока 1 -100 мл/мин - Необходимость наполнения резервуара Возвратнопоступательного типа - Содержат 1 -3 головки, чем больше, тем лучше - Малые объемы в головке, 50 250 мл - Инертные материалы - Непрерывное использование - Наличие гасителя пульсов

Схема насоса возвратно-поступательного типа колонка двигатель уплотнитель Возвратно поступательный поршень демпфер пульсов Шаровые пропускные Схема насоса возвратно-поступательного типа колонка двигатель уплотнитель Возвратно поступательный поршень демпфер пульсов Шаровые пропускные клапаны растворитель

Система дозирования проб üПетля объемом 5 -100 мкл, 6 -ходовый кран üШприцевого типа Система дозирования проб üПетля объемом 5 -100 мкл, 6 -ходовый кран üШприцевого типа

Соединения в ВЭЖХ Важно! Отсутствие течи дает постоянное давление и скорость потока, как следствие Соединения в ВЭЖХ Важно! Отсутствие течи дает постоянное давление и скорость потока, как следствие эффективное разделение Перетягивание также нежелательно, так как ведет к выходу из строя уплотнителей

ДЕТЕКТОР – «ГЛАЗА» ХРОМАТОГРАФА В ВЭЖХ - это преобразователь концентрации анализируемого вещества, растворенного в ДЕТЕКТОР – «ГЛАЗА» ХРОМАТОГРАФА В ВЭЖХ - это преобразователь концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал, по изменению физических свойств жидкости Детектор Измеряемое физическое Чувствительсвойство ность, г Селективность Спектрофотометрический Оптическая плотность на определенной длине волны (фильтр или монохроматор) 10 -9 Высокая Рефрактометрический Разность показателя преломления 10 -6 Низкая Флуорометрический Излучение света на определенной длине волны 10 -11 Очень высокая Амперометрический Ток окисления или восстановления 10 -9 - 10 -11 Очень высокая Кондуктометрический Электропроводность элюента 10 -10 Низкая Масс-спектрометрический Ионный поток, возникающий при различных энергетических воздействиях 10 -9 Средняя

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Из колонки Спектрофотометрический детектор – регистрирует изменение интенсивности падающего на кювету СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Из колонки Спектрофотометрический детектор – регистрирует изменение интенсивности падающего на кювету света при прохождении через нее элюата. Кварцев ые окна Источник света Детектор На сброс Достоинства Объем кюветы 1 -10 мкл ü Универсальный (возможен анализ практически всех групп веществ) ü Неразрушающий вид детектирования ü Прост в аппаратурном оформлении ü Доступен для большинства лабораторий ü Обладает достаточно высокой чувствительностью (до 10 -12 г в пробе)

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ ελ - коэффициент экстинкции (мера способности поглощения данного монохроматического излучения). Монохроматический СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ ελ - коэффициент экстинкции (мера способности поглощения данного монохроматического излучения). Монохроматический свет (световые колебания одной частоты) от источника L (лампа) интенсивностью I 0 падает на кювету длиной l (оптический путь). Кювета заполнена раствором вещества с концентрацией С. Вещество способно поглощать излучение. Из кюветы выходит ослабленный световой пучок интенсивностью I.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Закон Бугера-Ламберта-Бера I – интенсивность светового потока после прохождения кюветы; I СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Закон Бугера-Ламберта-Бера I – интенсивность светового потока после прохождения кюветы; I 0 – интенсивность падающего светового потока; ε - экстинкция; С – молярная концентрация вещества в кювете; l – длина кюветы.

Типы фотометрических детекторов: üФотометры с набором светофильтров на несколько длин волн; üСпектрофотометры с фиксируемой Типы фотометрических детекторов: üФотометры с набором светофильтров на несколько длин волн; üСпектрофотометры с фиксируемой для всего анализа длиной волны – любой из полного диапазона; üСпектрофотометры с возможностью переключения длины волны на разных участках хроматограммы; üСканирующие спектрофотометры с циклическим переключением нескольких длин волн в процессе и с возможностью записи спектра при остановке потока. дейтериевая лампа делитель луча фотодиод сравнения зеркало щель компаратор решетка фотодиод кювета усилитель

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ СРАВНЕНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ СРАВНЕНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ МНОГОВОЛНОВОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ МНОГОВОЛНОВОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ

Исследуемые смеси: Полиароматические углеводороды (ПАУ) Нафталин Фенантрен Антрацен Пирен Бензапирен В химической структуре – Исследуемые смеси: Полиароматические углеводороды (ПАУ) Нафталин Фенантрен Антрацен Пирен Бензапирен В химической структуре – от двух и более конденсированных колец. При комнатной t – твердые вещества, хорошо растворимы в орг. растворителях, малорастворимы в воде.

Полиароматические углеводороды (ПАУ) Техногенные источники: -предприятия энергетического комплекса, - автомобильный транспорт, - химическая и Полиароматические углеводороды (ПАУ) Техногенные источники: -предприятия энергетического комплекса, - автомобильный транспорт, - химическая и нефтеперерабатывающая промышленность. - термические процессы, связанные со сжиганием и переработкой нефтепродуктов, угля, древесины, мусора, пищи, табака и др. Природные источники: -репеленты некоторых растений и животных, - летучие метаболиты грибов, - процессы горения биомассы, - извержения вулканов, - обнаружены на метеоритных частицах.

Полиароматические углеводороды (ПАУ) Получение: из каменноугольной смолы Полиароматические углеводороды (ПАУ) Получение: из каменноугольной смолы

Применение и значение ПАУ Перенос в биогеохимических циклах, накопление в тканях организмов Канцерогенное, мутагенное, Применение и значение ПАУ Перенос в биогеохимических циклах, накопление в тканях организмов Канцерогенное, мутагенное, тератогенное воздействие, кожные и аллергические заболевания Необходимость мониторинга в окружающей среде: воздухе, воде, почвах Синтез красителей, взрывчатых веществ, инсектицидов и пр.

Значение ПАУ Необходимость мониторинга в окружающей среде: воздухе, воде, почвах Бенз(а)пирен - наиболее типичный Значение ПАУ Необходимость мониторинга в окружающей среде: воздухе, воде, почвах Бенз(а)пирен - наиболее типичный химический канцероген в окружающей среде; - опасен для человека даже при малой концентрации, поскольку обладает свойством биоаккумуляции. Согласно российским нормативам ГН 2. 1. 6. 695 -98 и ГН 2. 1. 6. 1338 -03 ПДК для бензапирена в воздухе ПДКсс = 0, 1 мкг/100 м 3 = 10 -9 г/м 3 Содержание бенз(а)пирена в питьевой воде составляет 0, 3 -2, 0 нг/л.