Выделение тотальной почвенной ДНК с использованием SDS

«Выделение тотальной почвенной ДНК с использованием SDS и лаурилсаркозината натрия» Выполнил: Селиверстова Екатерина магистрант 2 -ого года обучения Химического ф-та ЮФУ Руководители: Войкина Анна Владимировна к. б. н. , ассистент химического факультета ЮФУ Сазыкин Иван Сергеевич к. б. н. , ведущий научный сотрудник лаборатории экологии и молекулярной биологии микроорганизмов Академии биологии и биотехнологии ЮФУ Ростов-на-Дону, 2016

Актуальность исследования определяется: • Ролью изучения почвенной ДНК в понимании структуры сообществ микроорганизмов в почве • Спецификой выделения ДНК из почвы (высокое содержание гуминовых кислот) • Сравнительно небольшим количеством эффективных методик выделения

Цель исследования: Разработка и применение метода для выделения ДНК из почвы, основанного на использовании лаурилсаркозината натрия и SDS в качестве основных детергентов Задачи исследования: • Разработать методику использования лаурилсаркозината натрия и SDS для выделения почвенной ДНК • Провести извлечение ДНК из почвенных образцов, согласно разработанной процедуре • Осуществить качественный анализ ДНК, выделенной в ходе исследования • Сравнить эффективность лаурилсаркозината натрия и SDS как основных детергентов для извлечения почвенной ДНК; оценить влияние применения растворов гуанидин хлорида и СТАВ на ход выделения

Выбор методики выделения ДНК зависит от поставленной задачи, времени анализа и очистки, назначения выделяемой ДНК, характера первичного материала, оснащенности лаборатории и т. д.

Экстракция ДНК органическими растворителями «+» • Получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации • Применимость для различных объектов • Эффективность в случае работы со старым материалом • Стабильность и длительное хранение выделенной ДНК «-» • Токсичность растворителей • Существенные временные затраты • Возможность контаминации проб чужеродной ДНК • Трудность автоматизации • Не всегда удаляет ингибиторы ПЦР

Этапы экстракции ДНК: • Физическое воздействие (замораживание-оттаивание образца, гомогенизация с бусинами, дробление частиц почвы ультразвуком и т. п. ) • Химический лизис (обработка детергентами или хаотропными агентами) • Ферментативный лизис (применение лизоцима, протеиназы К) • Очистка полученного препарата ДНК

Оптимизация методики: Определение оптимальной концентрации лаурилсаркозината натрия Определение оптимальной концентрации SDS • серия опытов с использованием 0, 5%, 1%, 2% и 4% растворов SDS, с лаурилсаркозината натрия, с добавлением и без добавления раствора гуанидин хлорида. Влияние СТАВ (0, 05%, 0, 1%, 0, 2%, 0, 5% и 1% р-ры)

Качественный анализ ДНК Флуоресцентные красители: этидиум бромид; Sybr Green

Визуализация ДНК под действием УФ - лучей Рис. 1 Рис. 2 Рисунок 1 - Использование лаурилсаркозината натрия для выделения тотальной ДНК из почвы. Рисунок 2 – Использование лаурилсаркозината натрия совместно с раствором гуанидин хлорида 1 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 0, 5 % лаурилсаркозината натрия; 2 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 1 % лаурилсаркозината натрия; 3 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % лаурилсаркозината натрия; 4 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 4 % лаурилсаркозината натрия.

Рис. 3 Рис. 4 Рисунок 3 - Использование SDS без раствора гуанидин хлорида Рисунок 4 - Использование SDS совместно с раствором гуанидин хлорида для выделения тотальной ДНК из почвы. 1 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 0, 5 % раствора SDS; 2 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 1 % раствора SDS; 3 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % раствора SDS; 4 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 4 % раствора SDS.

Рисунок 5 - Влияние СТАВ на выделение тотальной ДНК из почвы. 1 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 4 % лаурилсаркозината натрия, 240 m. M раствора гуанидин хлорида и 0, 05 % СТАВ; 2 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 4 % лаурилсаркозината натрия и 0, 1 % СТАВ; 3 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 4 % лаурилсаркозината натрия и 0, 2 % СТАВ; 4 – экстракт ДНК, выделенной с использованием 4 % лаурилсаркозината натрия и 0, 5 % СТАВ; 5 – экстракт ДНК, выделенной с использованием лаурилсаркозината натрия и 1 % СТАВ; 6 - экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % SDS и 0, 05 % СТАВ; 7 - экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % SDS и 0, 1 % СТАВ; 8 - экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % SDS и 0, 2 % СТАВ; 9 - экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % SDS и 0, 5 % СТАВ; 10 - экстракт ДНК, выделенной с использованием 2 % SDS и 1 % СТАВ; ЛС + СТАВ SDS +СТАВ Рис. 5

Выводы: • Выделение ДНК в случае использования лаурилсаркозината натрия возможно без применения раствора гуанидин хлорида • При использовании в качестве детергента SDS лучше использовать его совместно с раствором гуанидин хлорида • Оптимальными концентрациями являются для SDS – 2%, для лаурилсаркозината – 4% • Добавление 1 % СТАВ к растворам лаурилсаркозината натрия и SDS и 0, 5 % СТАВ к раствору SDS вызвало уменьшение количества выделенной ДНК Исследование выполнено при поддержке Южного федерального университета, грант № 213. 01– 07– 2014/12 ПЧВГ.

Список использованной литературы: • Российская академия сельскохозяйственных наук. Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии. Выделение ДНК из образцов почвы: методические указания. – СПб. : 2011. – 24 с. • Кулмамабетова Г. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана. – 2012. • Селиверстова Е. Ю. , Сазыкин И. С. , Сазыкина М. А. , Хмелевцова Л. Е. , Рынза И. С. Использование различных концентраций лаурилсаркозината натрия и SDS для выделения ДНК из почвы // Валеология. – 2015. - № 3. – С. 42 -46 • Манучарова Н. А. Молекулярно-биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии: Учебное пособие. – М. Издательство МГУ, 2010. – С. 47 • Rajendhran J. , Gunasekaran P. Strategies for accessing soil metagenome for desired applications // Biotechnology Advances. – 2008 – V. 26 – P. 576– 590 • Zhou, J. et all // Appl Environ Microbiol. – 1996. – Vol. 62 (2). – P. 316– 322.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

Объект исследования: • Выделение ДНК из почвы Предмет исследования: • Выделение почвенной ДНК с помощью лаурилсаркозината натрия и SDS Гипотеза: • Лаурилсаркозинат натрия и SDS могут использоваться в качестве основных детергентов при извлечении ДНК из почвы Методы: экстракция ДНК органическими растворителями Лаурилсаркозинат натрия