Выделение и визуализация нуклеиновых кислот Что такое

Выделение и визуализация нуклеиновых кислот

Что такое нуклеиновые кислоты? Нуклеиновая кислота- высокомолекулярное органическое соединение, биополимер (полинуклеотид), образованный остатками нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК присутствуют в клетках всех живых организмов и выполняют важнейшие функции по хранению, передаче и реализации наследственной информации. Растительные ДНК (нуклеиновые кислоты)

Строение нуклеиновых кислот • Полимерные формы нуклеиновых кислот называют полинуклеотидами. • Цепочки из нуклеотидов соединяются через остаток фосфорной кислоты (фосфодиэфирная связь). Поскольку в нуклеотидах существует только два типа гетероциклических молекул, рибоза и дезоксирибоза, то и имеется лишь два вида нуклеиновых кислот — дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК). Фрагмент полимерной цепочки ДНК • Мономерные формы также встречаются в клетках и играют важную роль в процессах передачи сигналов или запасании энергии. Наиболее известный мономер РНК — АТФ, аденозинтрифосфорная кислота, важнейший аккумулятор энергии в клетке.

Виды нуклеиновых кислот ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) РНК (рибонуклеиновая кислота) • Сахар — дезоксирибоза • Азотистые основания: пуриновые — гуанин (G) и аденин (A) пиримидиновые — тимин (T) и цитозин (C) • ДНК часто состоит из двух полинуклеотидных цепей, направленных антипараллельно. • Сахар — рибоза • Азотистые основания: пуриновые — гуанин (G) и аденин (A) пиримидиновые — урацил (U) и цитозин (C). • Молекулы РНК часто имеют различные вторичные и третичные структуры(из-за особенностей рибозы ), образуя комплементарные участки между разными цепями.

Выделения нуклеиновых кислот

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ЖИДКОФАЗНЫЕ МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНЫЕ МЕТОДЫ • Классические методы выделения • Метод выделения нуклеиновых кислот на стекле • Методы, позволяющие выделить ДНК и РНК одновременно • Метод на основе магнитной сепарации Наборы для выделения и очистки нуклеиновых кислот

Классические методы Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНК используется фенол-хлороформная экстракция. При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней (водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе. Гелеобразный осадок нуклеиновой кислоты

Методы, позволяющие выделить ДНК и РНК одновременно • При этом используются сильные хаотропные агенты, такие как гуанидин агенты тиоцианат и цезия трифлуороацетат для одновременного разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз). • Лимитирующими факторами таких методик являются необходимость ультрацентрифугирования и большое время анализа (16– 44 ч). гуанидин тиоцианат трифлуороацетат

Метод выделения нуклеиновых кислот на стекле • Этот метод включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом, который разрушает клеточные мембраны и инактивирует внутриклеточные РНКазы, и последующую сорбцию нуклеиновой кислоты на носителе (стеклянные бусы, и т. д. ). • Нуклеиновая кислота обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата). гуанидин хлорида гуанидин тиоцианат

Метод на основе магнитной сепарации • Таким способом можно отделять компоненты клеточного лизата, которые ингибируют ДНК-полимеразу и ПЦР-реакцию, например полисахариды, фенольные компоненты, гумус. • Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием. • Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Express Magnetic Particle Processors - прибор для выделения нуклеиновых кислот на магнитных частицах

Визуализация нуклеиновых кислот • Электрофорез — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру и форме. • Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. • Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. • К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель, чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс. • После разделения фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФлучах.

Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют электрофорез в полиакриламидном геле для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования электрофорез в агарозном геле для относительно длинных молекул ДНК

Фотография агарозного геля после ДНК-электрофореза. Левая дорожка — фрагменты ДНК известной длины Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длиной волны 312 нм.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ВИЗУАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ

Стадии выделения белков: • выбор исходного материала; • разрушение клеток и экстракция; • выделение исследуемого белка из смеси других белков, т. е. очистка и получение индивидуального белка.

Способы разрушения клеток: - лизис клеток с помощью осмотического шока, - разрушение под действием ферментов (лизоцима и др. ), - химическая солюбилизация, - механическое, разрушение при котором используют лопастной гомогенизатор, - с помощью пресса, ультразвука - ручное шлифование с помощью ступки и пестика в жидком азоте - замораживание /оттаивание,

Осаждение белков • Высаливание ( сульфат аммония) • Осаждение органическими растворителями (ацетон, спирт)

Ультрацентрифугирование

Гельфильтрация Седафексы – это поперечно-сшитые декстраны с заданными размерами пор.

Аффинная хроматография

Адсорбционная хроматография

Распределительная хроматография

Электрофорез: 1)SDS-PAGE по Лэммли:

Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке

2)Электрофорез в градиенте пористости ПААГ SDS-PAGE-gels

3) ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ • Изоэлектрическая точка – это значение р. Н, при котором суммарный заряд вещества равен нулю. • Амфолиты – это соединения, обладающие как кислотными, так и основными свойствами.

4) 2 D-электрофорез