Выделение ДНК Лабораторная работа № 3 для студентов

Выделение ДНК Лабораторная работа № 3 для студентов специальности «Микробиология»

Подходы к выделению ДНК • Существующие методы выделения ДНК различаются между собой по нескольким параметрам: • а) чистотой конечного продукта; • б) временем, необходимым для его получения; • в) применимостью для выделения больших (или, напротив, небольших) количеств продукта • В зависимости от природы клеточной стенки бактерии могут быть разрушены • 1) с помощью одного лишь детергента, • 2) с использованием сочетания действия детергентов и гидролитических ферментов • 3) с помощью физических методов, таких как разрушение под действием ультразвука, в результате резкого изменения давления или при встряхивании со стеклянными шариками. • Выход ДНК их культур, находящихся в стационарной фазе часто оказывается ниже, чем из культур в логарифмической фазе.

Подходы к очистке ДНК • Очистка раствора с помощью методов органической экстракции (с помощью фенола, хлороформа) с последующим осаждением ДНК спиртами и растворением в воде и ТЕ-буфере. • На основных принципах этого подхода базируется ставшая уже классической методика Мармура, позволяющая получить чистый препарат ДНК, но с существенными временными затратами. метод позволяет выделять в чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между собой ДНК и РНК. • Принципиальная основа метода заключается в том, что НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в органических растворителях. • Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле. При p. H 7– 8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (р. Н < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осаждением с изопропиловым спиртом.

Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол -хлорофорной экстракции

Подходы к очистке ДНК • Дифференциальная сорбция ДНК на твердом носителе (чаще всего силикагели с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной поверхностью), после нескольких стадий отмывки сорбента с локализованной на его поверхности ДНК органическими растворителями ДНК смывается водой или ТЕ- буфером. • Принцип данного метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (водородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д. ), и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной силой. • С помощью данного метода можно быстро и эффективно выделить ДНК из агарозного геля, а также ферментативных смесей – ПЦР, рестрикции и т. д. Более эффективно происходит выделение фрагментов ДНК от 0. 1 т. н. п. и до 10 т. н. п. , которые избирательно сорбируются на фильтре спин- колонки, промываются этанол-содержащим буфером и элюируются низкосолевым буфером.

Схема выделения нуклеиновых кислот с использованием различного рода сорбентов

Подходы к очистке ДНК • В первом случае можно выделить более высокомолекулярную ДНК, однако возможны значительные потери ДНК, а также остаточные загрязнения протеинами, фенолом и хлороформом, затрудняющими последующие манипуляции с ДНК. • При использовании методов, основанных на сорбции ДНК, наблюдается высокая степень очистки, однако, возможна ее сильная фрагментация, а остаточные количества сорбента в конечном растворе ДНК также могут ингибировать ферментативные реакции.

Проведение процедуры • На сегодняшний день существует большое разнообразие коммерческих наборов для выделения ДНК.

Выделение плазмидной ДНК • Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее довольно легко выделить в чистом виде. • Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, сильно затрудняется и выход оказывается невысоким. • Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв водородных связей в хромосомной ДНК (при нагревании или в щелочных растворах). При охлаждении или возвращении к нейтральному p. H замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, в то время как хромосомная ДНК остается денатурированной. • В дальнейших процедурах очистки плазмиды (если это необходимо) из препаратов ДНК удаляют оставшиеся белки и РНК.