Вятский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Выпускная квалификационная работа магистра на тему: Разработка иммунохроматографической тест-системы для экспрессной диагностики хеликобактериоза Работу выполнила: Мокрецова Ирина Михайловна Руководитель: д. м. н. , доцент Богачёва Наталья Викторовна
2 Работа выполнена на кафедре микробиологии Вятского государственного университета
Инфицированность H. pylori достигает 80% 3 Проблема – хеликобактериоз Хронические заболевания ЖКТ Рак желудка – 327 тыс. новых случаев ежегодно Бактериологический метод Решение проблемы – диагностика хеликобактериоза Дыхательные тесты ПЦР ИФА ИХА Перспективы совершенствования диагностики Разработка новых иммунохроматографических тест-систем для идентификации патогенных штаммов H. pylori
Оснащенность рынка иммунохроматографическими тест-системами 4 Название тестсистемы Специфические компоненты Биологический материал Недостатки Immuno. Card STAT Hp. SA (Meridian Bioscience, Inc. , США) Моноклональные анти-H. pylori антитела Кал - Строгие требования к материалу - Тест строго качественный - Возможен ложноотрицательный результат Хелико Стик (Novamed, Израиль) Моноклональные антитела к уреазе Кал - Возможно обнаружение уреазы, продуцируемой другими микроорганизмами SD BIOLINE H. pylori Ag (Standard Diagnostics, Inc. , Республика Корея) Моноклональные антитела к антигену H. pylori Кал - Тест строго качественный - Низкая чувствительность
5 Цель проекта – разработка и создание иммунохроматографической тест-системы экспрессной диагностики хеликобактериоза. для
6 Задачи исследования Проанализировать данные литературы и изучить общие подходы к разработке иммунохроматографических тест-систем. Провести оценку серий коллоидного золота, полученных при использовании отработанной методики синтеза наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм. Определить оптимальную концентрацию моноклональных антител для выбранных серий коллоидного золота. Проанализировать полученные варианты конъюгатов антител с коллоидным золотом. Разработать различные варианты иммунохроматографической тест-системы для идентификации H. pylori. Провести идентификацию музейных культур H. pylori с целью выбора изолятов для тестирования разработанных вариантов тест-системы. Оценить чувствительность и специфичность разработанных вариантов тестсистемы. Предложить пути улучшения специфичности и чувствительности разработанной тест-системы.
7 Внешний вид и схема иммунохроматографической тест-системы Мышиные Мк. АТ к Cag. A белку H. pylori Конъюгат НЧКЗ с мышиными Мк. АТ к H. pylori 7 Антивидовые кроличьи антитела к Ig. G мыши
8 Алгоритм получения НЧКЗ по методу Френса 1. Приготовить 1% раствор цитрата натрия. 2. Приготовить 10% раствор золотохлористоводородной кислоты. 3. В колбу Эрленмейера внести 50 мл деионизированной воды и магнитную мешалку. Надеть на колбу дефлегматор, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить режим 375 об/мин и 300◦С. 4. Через 6 мин внести 0, 058 мл 10% раствора ЗХВК, кипятить 2 мин. 5. Внести 0, 72 мл 1% раствора цитрата натрия. 6. При изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на 500 об/мин и 200 ◦С. 7. Кипятить раствор еще 20 мин. 8. Выключить плитку, снять дефлегматор, остудить раствор при комнатной температуре в течение суток, затем хранить в холодильнике при 4 ◦С.
9 Характеристики НЧКЗ серий № 10/1 и 12/1 Признак КЗ № 10/1 КЗ № 12/1 Диаметр НЧКЗ по результатам электронной микроскопии, нм 26, 7 30, 0 Форма частиц Сферические, овальные Однородность Однородные Наличие конгломератов Нет Оптическая плотность максимального пика поглощения, ЕД 1, 020 0, 867 Длина волны максимального пика поглощения, нм 526 525 Диаметр НЧКЗ по результатам спектрофотометрии, нм 30 20 -30
10 Алгоритм определения «золотого числа» 1. Все серии КЗ доводили 0, 2 М карбонатом калия до р. Н 9, 5. 2. Во все лунки восьми горизонтальных рядов 96 -луночного круглодонного планшета вносили 0, 005 М карбонатно-бикарбонатный буфер с p. H 9, 5. 3. В первые лунки планшета вносили растворы Мк. АТ. 4. Титровали содержимое лунок слева направо путем переноса 100 мкл растворов Мк. АТ из каждой предыдущей лунки в каждую последующую. 5. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в двух повторах) вносили по 100 мкл КЗ. 6. Содержимое лунок инкубировали 15 мин. 7. По окончании инкубации в каждую лунку вносили 10% раствор хлорида натрия. 8. Содержимое лунок перемешивали. 9. Инкубировали 10 мин.
11 Результаты определения ЗЧ для Мк. АТ-387 с КЗ № 10/1 и 12/1
12 Варианты конъюгатов (номер конъюгата), приготовленных на 0, 025 М … ФБС СББ Мк. АТ-1811 + КЗ № 10/1 (1. 1) Мк. АТ-1811 + КЗ № 10/1 (2. 1) Мк. АТ-1811 + КЗ № 12/1 (1. 2) Мк. АТ-1811 + КЗ № 12/1 (2. 2) Мк. АТ-387 + КЗ № 10/1 (1. 3) Мк. АТ-387 + КЗ № 10/1 (2. 3) Мк. АТ-387 + КЗ № 12/1 (1. 4) Мк. АТ-387 + КЗ № 12/1 (2. 4)
13 Алгоритм получения конъюгатов 1. р. Н раствора КЗ доводили до 9, 0 с помощью 0, 2 М карбоната калия. 2. К 2 мл раствора КЗ добавляли по каплям при постоянном перемешивании 2 мл раствора Мк. АТ с концентрацией 40 мкг·см-3, получая конечную концентрацию Мк. АТ 20 мкг·см-3. 3. Содержимое пробирки инкубировали 30 мин при комнатной температуре, перемешивая каждые 10 мин на вортексе. 4. К 4 мл конъюгата Мк. АТ с КЗ добавляли 10 мкл профильтрованного 4% ПЭГ 20 000. 5. Содержимое пробирки инкубировали 15 мин. 6. 4 мл конъюгата КЗ с Мк. АТ наслаивали в центрифужной пробирке на стабилизирующий раствор и центрифугировали при ускорении 7500 g 70 мин при +4° С. 7. По окончании центрифугирования супернатант из пробирки осторожно удаляли дозатором, осадок ресуспендировали до объема 1 мл 0, 025 М Трис-буфером с 0, 25% ПЭГ 20 000. 8. Анализировали конъюгат на спектрофотометре, для чего разбавляли его в 10 раз 0, 025 М Трис-буфером с 0, 25% ПЭГ 20 000.
14 Результаты спектрофотометрии различных серий конъюгата Вариант конъюгата* Длина волны, нм Оптическая плотность, ЕД 1. 1 530 1, 100 2. 1 532 1, 220 1. 2 528 1, 008 2. 2 530 1, 065 1. 3 534 1, 300 2. 3 534 1, 553 1. 4 532 1, 189 2. 4 533 1, 256 «*» – состав вариантов конъюгатов представлен на слайде 12
15 Сборка мультимембранного композита
16 Варианты иммунохроматографических тест-систем Вариант тест-системы Мк. АТ в конъюгате Антитела в аналитической зоне 1 1811 387 2 1811 Пк. АТ 3 387 1811 4 387 Пк. АТ
17 Нанесение антител на рабочую мембрану Антитела Концентрация Моноклональные 4, 0 мг·см-3 0, 025 М СББ 10, 0 мг·см-3 0, 025 М СББ Дозатором по 0, 5 мкл в виде точки Контрольная Дозатором по 0, 5 мкл в виде точки или полосы 5, 0 мг·см-3 0, 025 М ФБС Антивидовые Условия нанесения Аналитическая Поликлональные Зона нанесения
18 Проверка музейных культур H. pylori с использованием коммерческой тест-системы «H. pylori Тест» ( «Novamed» , Израиль) Положительные результаты тестирование культур H. pylori: красная полоса в аналитической зоне свидетельствует о наличии микроорганизма в пробе; зеленая полоса в контрольной зоне свидетельствует о правильном проведении анализа и пригодности тест-системы для анализа Отрицательные результаты тестирования культур H. pylori – наличие только зеленой полосы в контрольной зоне
19 Проверка разработанной тест-системы Общий вид изготовленных иммунохроматографических тест-полосок Положительные результаты (слева): розовая точка – окрашенная аналитическая зона, розовая полоса – окрашенная контрольная зона Отрицательные результаты (справа): только розовая полоса – окрашенная контрольная зона
20 Предложения по улучшению специфичности и чувствительности разработанной тест-системы Увеличение концентрации антител в аналитической зоне. Изготовление и проверка варианта тест-системы, представляющего комбинацию Мк. АТ-387 в конъюгате с КЗ № 10/1 с этими же Мк. АТ в аналитической зоне. Использование для приготовления конъюгатов других буферных растворов. Изучение возможности комбинации различных буферных растворов на этапах разведения антител, отмывки конъюгата, тестирования образцов.
21 Выводы 1. Изучены и отработаны общие иммунохроматографических тест-систем. подходы к разработке 2. Проведена оценка серий коллоидного золота, полученных при использовании отработанной методики синтеза наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм. 3. Определена оптимальная концентрация выбранных серий коллоидного золота. моноклональных антител для 4. Проанализированы полученные варианты конъюгатов антител с коллоидным золотом. 5. Разработаны различные варианты иммунохроматографической тест-системы для идентификации H. pylori. 6. Проведена идентификация музейных культур H. pylori с целью выбора изолятов для тестирования разработанных вариантов тест-системы. 7. Дана оценка чувствительности и специфичности разработанных вариантов тест-системы. 8. Предложены пути улучшения разработанной тест-системы. специфичности и чувствительности
22 Практические предложения Использовать разработанный вариант иммунохроматографической тест-системы для идентификации культур в условиях экспериментальных микробиологических лабораторий. Использовать алгоритм изготовления иммунохроматографической тест-системы при дальнейшем её совершенствовании, применяя рекомендации по повышению чувствительности и специфичности. Подготовить проект статьи практическом журнале. для публикации в научно-
23 Результаты работы опубликованы в виде финального отчёта для конкурса «УМНИК» в январе 2015 г.
24 Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д. м. н. , доценту кафедры микробиологии Богачёвой Наталье Викторовне, студентке кафедры микробиологии Лежниной Ксении Евгеньевне.
Скачать презентацию Вятский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Выпускная
Презентация по тайм-менеджменту. Мокрецова.ppt