Вятский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Дипломная

Вятский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Дипломная работа на тему: Теоретическое и экспериментальное обоснование состава конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H. pylori Работу выполнила: Лежнина К. Е. Руководитель: д. м. н. , доцент Богачева Н. В.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Вятского государственного университета 2

Актуальность разработки иммунохроматографических тест-систем для диагностики хеликобактериоза Иммунохроматографический анализ с успехом используется для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний благодаря своей высокой специфичности, чувствительности и простоте манипуляций при проведении анализа. 3

Цель исследования – отработка условий приготовления коллоидного золота с заданным размером частиц, обоснование выбора концентрации Мк. Ат для дальнейшего приготовления конъюгата с сериями КЗ. 4

Задачи исследования: теоретически обосновать и экспериментально отработать методику приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм; с использованием метода электронной микроскопии и спектрофотометрии провести оценку полученных серий КЗ и выбрать наиболее кондиционные по данному этапу исследования серии КЗ; с помощью постановки реакции по определению «золотого числа» провести оценку адсорбционной способности серий КЗ с Мк. Ат ; теоретически и экспериментально обосновать состав конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H. pylori. 5

Получение наночастиц КЗ по методу Френса Условия эксперимента № серии КЗ 4 4/1 5 5/1 6 6/1 Обороты мешалки в 375 начале эксперимента, об/мин 375 375 375 Обороты мешалки с момента появления красной окраски, об/мин 500 1000 Время кипячения, мин 10 10 20 20 30 30 Диаметр частиц, нм 5 -10 15 -20 15 15 6

Получение наночастиц КЗ по методу Френса 1 М (HAu. Cl 4· 3 H 2 O) = 393, 967 г/моль, 1 М (HAu. Cl 4) = 339, 967 г/моль. 1 М (HAu. Cl 4) / 1 М (HAu. Cl 4· 3 H 2 O) = 0, 863. 1 мл (HAu. Cl 4) / 0, 863 = 1, 159 мл. Для получения 10 мл 1% золотохлористоводородной кислоты – в 10 раз меньше – 0, 1159 мл. Использовали по 0, 058 мл 10% раствора золотохлористоводородной кислоты. 7

Получение наночастиц КЗ по методу Френса Условия эксперимента № серии КЗ 8 Условия внесения золота В подогретую воду, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия При закипании, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия Время до закипания, мин 3 6 30 15 -20 20 -30 8/1 6 10 3 Обороты мешалки 800 в начале эксперимента, об/мин 12 12/1 375 Обороты мешалки 800 с момента появления красной окраски, об/мин 10/1 500 Диаметр частиц, нм 40 40 -50 20 -30 8

Результаты визуального и спектрофотометрического анализа КЗ серии № 8 -8/1 Рис. 2 – График светопоглощения раствора КЗ серии № 8 и 8/1. Рис. 1 – Визуальная оценка раствора КЗ серии № 8 и 8/1. 9

Результаты визуального и спектрофотометрического анализа КЗ серии № 10, 10/1, 12/1 Рис. 4 – График светопоглощения раствора КЗ серии № 10, 10/1, 12/1. Рис. 3 – Визуальная оценка раствора КЗ серии № 10, 10/1, 12/1. 10

Оптимальные условия для синтеза наночастиц КЗ время для внесения золотохлористоводородной кислоты (цитрата натрия) - 6 мин режим перемешивания - 500 об/мин объем 10% золотохлористоводородной кислоты – 58 мкл объем 1% цитрата натрия - 720 мкл 11

Перечень антител, используемых для получения конъюгата с наночастицами КЗ Наименование Изотип Концентраци я, мг мл-1 Характеристик а буфера Мышиные моноклональные антитела к белку Cag. A Helicobacter pylori. Клон HP-1811 Ig. G 4, 5 фосфатносолевой буфер, р. Н 7, 4, 0, 1 % азид натрия Мышиные моноклональные антитела к белку Cag. A Helicobacter pylori. Клон HP-387 8, 0 Антитела поликлональные кроличьи Ig. G pab Rabbit anti Helicobacter pylori 5, 0 0, 01 М фосфатносолевой буфер, р. Н 7, 2 0, 1% азид натрия 12

Постановка реакции для определения «золотого числа» «Золотое число» - минимальное защитное количество гидрофильного полимера, способного адсорбироваться на поверхности 10 мл золя золота и предотвращать его коагуляцию при добавлении к нему 1 мл 10% раствора Na. Cl. 13

Постановка реакции для определения «золотого числа» использовали серии КЗ № 10, 10/1, 12/1 Мк. Ат 1811 и 387 ( «Биалекса» , Россия) с концентрацией белка 4, 5 мг см-3 и 8, 0 мг см-3 14

15

Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для Мк. Ат 1811 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12/1 Серия Золотое число для Мк. АТ 1811 / 387 определено в КЗ лунке (1) и соответствует концентрации Мк. Ат (2), мкг·см-3 387 1811 1 2 10 4 3, 125 3 12, 5 10/1 5 6, 25 4 25, 0 12 4 3, 125 3 12, 5 12/1 5 6, 25 4 25, 0 16

Результаты определения «золотого числа» для Мк. Ат 387 и 1811 с серией КЗ № 10/1 при постановке реакции на 0, 005 М КББ 17

Зависимость спектра поглощения от концентрации Мк. АТ при длине волны 630 нм при титровании антител в диапазоне от 25 мкг • см-3 до 12, 5 мкг • см-3 с интервалом 2 мкг • см-3 18

Характеристика препаратов КЗ серий № 10/1 и 12/1 Признак КЗ № 10/1 КЗ № 12/1 26, 7 30 Форма Овальная, круглая Однородность Однородные Наличие конгломератов - - 1, 020 0, 867 max при λ=526 max при λ=525 30 20 -30 Диаметр частиц КЗ (dср) по данным электронной микроскопии, нм Результаты спектрофотометрии: оптическая плотность (ЕД), max пика поглощения; длина волны max пика поглощения при измерении в диапазоне λ=200 -600 нм Диаметр частиц КЗ (dср), определенный по результатам спектрофотометрии, нм 19

Результаты определения «золотого числа» • рекомендованы Мк. Ат 387 • «золотое число» (точка выхода графика на плато) для Мк. АТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см-3 • для Мк. АТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует 19 мкг·см-3 • рекомендуемая концентрация антител для конъюгации с сериями КЗ № 10/1 и 12/1 составляет, соответственно, 19, 5 мкг·см-3 и 23, 0 мкг·см-3 20

Выводы 1. 2. 3. 4. 5. Теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм; при отработке методики приготовления наночастиц КЗ с заданным размером экспериментально получено 12 серий препарата; с использованием метода электронной микроскопии и спектрофотометрии проведена оценка полученных серий КЗ и выбраны наиболее кондиционные по данному этапу исследования серии КЗ № 10, № 10/1, № 12/1 с размером частиц от 15 до 30 нм; с помощью постановки реакции по определению «золотого числа» проведена оценка адсорбционной способности четырех серий КЗ с выбранными для разработки ИХ тест-системы Мк. Ат к Сag белку H. pylori – Мк. Ат 1811 и Мк. Ат 387; теоретически и экспериментально обоснован состав конъюгата КЗ с антителами для разработки ИХ тест-системы, предназначенной для идентификации H. pylori: серии коллоидного золота 10/1 и 12/1 и Мк. Ат к Сag белку H. pylori клон 387 с 21

Практические предложения Рекомендовать применение предложенной схемы синтеза наночастиц КЗ для использования из в составе конъюгата с антителами для разработки ИХ тест-системы, предназначенной для идентификации H. pylori. Подготовить статью для публикации в научно-практическом журнале. 22

Результаты работы были опубликованы в виде тезисов на Всероссийской научной конференции «Наука – производство – технологии – экология» в апреле 2015 г. 23

Автор выражает глубокую благодарность дипломному руководителю д. м. н. , доценту кафедры микробиологии Богачевой Наталье Викторовне, магистранту кафедры микробиологии Мокрецовой Ирине Михайловне 24