ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ Структура и

ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ Структура и методы анализа ДНК

Нуклеиновые кислоты • 1869 году Фридрих Мишер, обнаружил новый класс органических соединений – нуклеиновые кислоты. • Нуклеиновые кислоты – природные высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу наследственной (генетической) информации в живых организмах. • Нуклеиновые кислоты представляют собой макромолекулы, образованные повторяющимися структурами – нуклеотидами.

Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: циклического азотсодержащего соединения, называемого «основанием» , сахара пентозы, включающего пять атомов углерода, и фосфорной кислоты. Известны пять главных азотистых оснований. Одно из них, урацил (2, 6 -оксипиримидин), обнаруживается только в РНК. Другое, тимин (2, 6 -окси-5 метилпиримидин), находится как правило, только в ДНК. Остальные три основания: цитозин (6 -амино- 2 оксипиримидин), аденин (6 -аминопурин) и гуанин (2 амино-6 -оксипурин) – присутствуют как в ДНК, так и в РНК. Двуциклические основания – аденин и гуанин – относятся к пуринам, моноциклические основания – цитозин, тимин и урацил – к пиримидинам. Тимин отличается от урацила наличием метильной группы ( СН 3), которая отсутствует в урациле. Сахар пентоза, входящий в состав РНК, является рибозой, а входящий в состав ДНК – 2 -дезоксирибозой. Часть нуклеотида, состоящая из сахара с присоединенным к нему азотистым основанием называют – нуклеозид. Поэтому нуклеотиды называются также

ДНК. Нуклеотидный состав ДНК впервые в 1905 г. проанализировал Э. Чаргафф. Стало известно, что 4 основания присутствуют в ДНК. Молекула ДНК имеет более сложную структурную организацию. Существенное значение для понимания строения ДНК имели установленные Э. Чаргаффом закономерности, в соответствии с которыми в любой молекуле ДНК: 1. Сумма нуклеотидов, содержащих пуриновые азотистые основания, равна сумме пиримидиновых нуклеотидов, т. е. А+Г=Т+Ц 2. Содержание аденина (А) равно содержанию тимина (Т), а содержание гуанина (Г) – содержанию цитозина (Ц), т. е. отношение А к Т и Г к Ц равно 1. 3. Количество оснований с кетогруппой в 6 м положении равно количеству оснований с аминогруппой в 6 м положении, т. е. Г+Т=А+Ц, или (Г+Т) / (А+Ц)=1. Эти правила выявили устойчивую взаимосвязь содержания Т и А с одной стороны и Ц и Г – с другой.

Большую роль в расшифровке строения ДНК сыграло рентгеноструктурное исследование, проведенное (1953) М. Уилкинсом и Р. Франклин. Оно показало, что ДНК – упорядоченная структура, состоящая из повторяющихся нуклеотидов, расположенных вдоль оси молекулы на расстоянии 0, 34 нм друг от друга, а на один виток спирали их приходится 10. Диаметр молекулы ДНК составляет около 2 нм.

Дезоксирибонуклеиновые кислоты представляют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроизводству или репликации, что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Записывается последовательность ДНК слева направо (5 3) первыми заглавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся одновременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах: от нескольких нуклеотидов до миллиардов пар оснований (п. о. ). В качестве единиц измерения размеров ДНК используют также килобазы (kb) и мегабазы (Mb) – последовательности, соответствующие тысяче и миллиону пар оснований соответственно.

Водородные связи между парами нуклеотидов достаточно непрочны, так что цепи ДНК могут легко диссоциировать – разделяться и ассоциировать – соединяться при изменении температуры или солевых концентраций. При каждом цикле ассоциации диссоциации или, как еще говорят, отжиге плавлении будет точно воспроизводиться двухнитевая структура – дуплекс, устойчивость которого определяется соответствием нуклеотидных пар. Процесс образования дуплексов носит название Гибридизации.

Схема реализации однонаправленного потока информации ДНК РНК белок составляет основу молекулярно биологической догмы. Репликация ДНК ген РНК м. РНК Белок

Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекулы ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 г сырой ткани или из 109 клеток обычно получают 2 мг ДНК.

У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови. Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядерные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих денатурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы К с последующей фенол хлороформной экстракцией разрушением белков. ДНК осаждают в этаноле и растворяют в буферном растворе.

Оценку качества ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280)>1, 8 где А(260) и А(280) – оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно.

В процессе сложного и многообразного функционирования различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные регулируемые и в основе своей обратимые изменения. Эти модификации осуществляются с помощью ферментов. Мы ознакомимся только с двумя классами ферментов: ДНК полимеразами и Рестриктазами.

Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК полимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот содержатся три различные формы ДНК полимераз, все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК в направлении 5 3, последовательно прибавляя по одному нуклеотиду к 3 ОН концу цепи, причем точность синтеза определяется комплементарностью. Таким образом, для работы ДНК полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с двухнитевым участком на 3 конце молекулы. Кроме того, в середине должны присутствовать четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (d. NTP: d. ATP, d. CTP, d. GTP, d. TTP) – молекул, состоящих из основания – А, С, G и T, сахара – дезоксирибозы (d) и трех (Т) фосфатных остатков (Р).

У эукариот репликацию осуществляет ДНК полимераза А. ДНК полимеразы обладают различными активностями, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3 5, что позволяет им исправлять – Репарировать – дефекты, допущенные при подборе комплементарных оснований. ДНК полимераза E. coli способна инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом НИК ТРАНСЛЯЦИИ.

Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и возможности генной инженерии. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознавания и защиты «своих» и уничтожения чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 6, реже 8 12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей называемых сайтами рестрикции.

Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов – характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность.

Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соответствующими первым трем буквам латинского названия вида бактерий. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают три класса рестриктаз: часто средне редкощепящие Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8 12 п. о. ), как правило, являются редкощепящими, а узнающие короткие – (4 5 п. о. ) – частощепящими.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Предложенный в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г. , альтернативный метод анализа геномной ДНК – метод полимеразной цепной реакции – явился эпохальным открытием молекулярной

Метод ПЦР (специфической амплификации ДНК) позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, реже до 1000 2000 п. о. , используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

Условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными Праймерами – олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно от 15 до 30 п. о. , комплементарными 3 концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.

Успех в разработке метода ПЦР связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы, выделенной из бактерий живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

Схема ПЦР Исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей 95 98 С. Дальнейшая схема заключается в чередовании циклов: гибридизация, или отжига, ДНК с праймерами; синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК; денатурация образовавшихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30 50 С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам.

Работа ДНК полимеразы, 60 70 С начинается синтез ДНК в направлении 5 3 с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до 80 90 С синтез прекращается, и двухнитевой участок между матричными и синтезированной молекулой ДНК расправляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режимам, а по достижении ДНК полимеразной границы амплифицированного участка, что и определяет, в конечном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами – температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапазоне от десятков секунд до 1 3 мин, так что полный цикл длится от одной до нескольких минут. За 25 30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы – термоциклеры или амплификаторы ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла

Все компоненты реакции – матричную ДНК, олигопраймеры, смесь d. NTP и термофильную ДНК полимеразу добавляют в специальный буфер, наслаивают небольшое количество вазелинового масла для предотвращения высыхания раствора, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительность каждого шага реакции. Общий объем реакционной смеси обычно составляет от 10 до 50 100 мкл. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка.

В качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищенной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, соскобы с цитогенетических препаратов, патологоанатомические анализы и длительно фиксированные ткани.

Существуют разлные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера анализа амплификатов. Для трудноамплифицированных участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или доамплификации, продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе.

Мультиплексная ПЦР одновременная амплификация нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые d. NTP. Как правило, амплифицированную ДНК можно наблюдать в проходящем УФ свете путем обычного окрашивания геля бромидом этидия.

Банк генетического материала С развитием молекулярно генетических технологий возникла необходимость сбора и сохранения генетического материала. Оптимальным был признан способ сохранения ДНК в виде банка, который представляет собой систему хранения образцов нуклеиновых кислот (American Society or Human Genetics, Ad the Committee on DNA technology, DNA Banking and DNA analysis: Points to Confider , 1998).

Схема банка ДНК и биологического материала Резервный образец крови объём 1, 5 мл Базовый образец ДНК, выделенный с использованием протеиназы К Рабочий образец ДНК, выделенный "экспресс-методом"

Для каждого человека банк должен содержать 3 единицы хранения: 1. Образец ДНК, выделенный с помощью высокопроизводительного метода с использованием протеиназы К (основной образец) 2. Образец ДНК, выделенный "экспресс методом" (рабочий образец) 3. Образец крови объёмом 1, 5 мл (резервный образец).

Экспресс-метод выделения ДНК 1. Кровь забирать в вакуумный контейнер "Vakuette" c ЭДТА. 2. Из вакуумного контейнера отобрать 0, 7 мл крови в пробирку типа "Эппендорф" объёмом 1, 5 мл. 3. В пробирку "Эппендорф" с кровью добавить раствор 1 х SSC. 4. Центрифугировать 2 мин. на микроцентрифуге при 10 тыс. об. /мин. 5. Надосадочную жидкость слить через край не до конца. 6. В пробирку добавить 1, 4 мл 1 x SSC и хорошо ресуспензировать осадок. 7. Центрифугировать на микроцентрифуге в том же режиме. 8. Повторить пункт 5. Оставшуюся каплю на краю пробирки промокнуть фильтровальной бумагой. 9. К осадку добавить 270 мл 0, 2% М ацетата натрия (р. Н 7). Хорошо разбить осадок на шейкере. Затем добавить 30 мл 10% SDS, еще раз перемешать. Инкубировать при 37°С один час. 10. В пробирки добавить 500 мл смеси фенол-

при 12 тыс. об. /мин. 20 мин. 12. Супернатант отобрать в чистую пробирку "Эппендорф", не захватывая интерфазу. 13. В пробирку с отобранной жидкостью добавить 1 мл 96% спирта. Плавными вращательными движениями руки "наматывать" ДНК саму на себя до появления небольшого белого комочка. 14. Центрифугировать 5 мин. на микроцентрифуге при 12 тыс. об/мин. , чтобы комочек прилип ко дну. 15. Слить спирт через край. Добавить 70% спирта, перемешать, отцентрифугировать, чтобы снова приклеить комочек. 16. Слить спирт, вытрясти его остатки, контролируя наличие ДНК на дне пробирки. Промокнуть фильтровальной бумагой края пробирки и оставить сохнуть на 20 мин. 17. Осадок растворять в 50 мл

Стандартный метод выделения ДНК 1. Кровь забрать в вакуумный контейнер "Vakuette" c ЭДТА. 2. Перелить в пробирки объёмом 50 мл и смешать с холодным буфером для гемолиза (EL). При объёме крови 5 10 мл, необходимое количество буфера составит 45 50 мл. 3. Инкубировать в ледяной бане 15 мин. , периодически перемешивая содержимое пробирок. 4. Центрифугировать 15 мин. при 2000 об/мин. при 4°С. 5. Супернатант убрать водоструйным насосом, оставив 1 см над осадком. 6. Ресуспензировать осадок в оставшемся объёме. 7. Добавить 45 мл EL и центрифугировать в том же режиме. 8. Супернатант слить через край одним движением руки. Горло пробирки промокнуть фильтровальной бумагой так, чтобы удалить остатки буфера. 9. К осадку добавить лизирующий буфер (LB). На 5 мл крови – 4 мл буфера. Ресуспензировать осадок и перелить содержимое в пробирку объёмом 15 мл. 10. Инкубировать в термостате при 56°С минимум 5 часов, лучше в течение ночи.

11. После инкубации в пробирки добавить фенол в соотношении 1: 1 к объёму содержимого. Хорошо, но осторожно перемешать содержимое 10 мин. до образования однородной эмульсии. 12. Центрифугировать 15 мин. при 3 тыс. об. /мин. 13. Верхнюю фазу осторожно отобрать в чистую пробирку, не забирая интерфазу. 14. К отобранной жидкости добавить смесь фенол/хлороформ 1: 1. Хлороформ при этом должен быть с изоамиловым спиртом в отношении 24: 1. Хорошо, но осторожно перемешать 10 мин. 15. Центрифугировать в том же режиме. 16. Верхнюю фазу отобрать в чистую пробирку и добавить к ней столько же хлороформа с изоамиловым спиртом. Хорошо перемешать и центрифугировать. 17. Верхнюю фазу отобрать, добавить к ней 5 М натрий хлор из расчёта 20 мкл на 1 мл полученной жидкости. 18. Затем добавить 96% спирта 2 объёма (на 5 мл раствора ДНК 10 мл спирта). 19. Кусочек ДНК переложить с помощью микропипетки в пробирку "Эппендорф" на 1, 5 мл. Добавить в него 1 мл 70% спирта для отмывки солей. Спирт слить так, чтобы "кусочек" ДНК остался в пробирке. 22. Залить деионизованной водой в зависимости от величины "кусочка" ДНК в количестве от 100 до 500 мкл.

Исследование больных раком желудка на наличие мутаций в гене CDH 1. При изучении первичной структуры ДНК гена CDH 1 у больных РЖ мутаций в данном гене CDH 1 обнаружено не было, но было выявлено 3 редких однонуклеотидных 1 2 3 4 5 6 7 8 9 варианта: 1896 С>T в 12 экзоне; 2253 C>T в 14 экзоне и 531+10 G>C в 4 интроне (рис. 1). 12 экзон 14 экзон

Мутации в генах MLH 1 и MSH 2 у больных с РЖ и с разной частотой рака толстой кишки и РЖ в семье. Вариант Ген Участок гена Тип варианта Онкологическ ие заболевания в семье P 355 L MLH 1 12 экзон Миссенсмутация РЖ-67 РЖ-62 del. AAG MLH 1 16 экзон Делеция РТК-42, 30, 56 1990 -2 A>G MLH 1 17 интрон Мутация сайта сплайсинга РТК-38, 50 1387 -8 G>T MSH 2 8 интрон Мутация сайта сплайсинга РЖ-58 РТК-56 -7 C>T MLH 1 Промоторная область Промоторный вариант РЖ-58 РЖ-62

28 S 18 S Рисунок 2. Электрофореграмма РНК, выделенной Axy. Prep Total RNA (Axygen, USA) из опухоли желудка. Видны бэнды: 28 S и 18 S рибосомальной РНК

Рисунок 3. Концентрация РНК в опухоли больной Л 3 до лечения (1) 48 нг/мкл и больной К 1 до лечения (2), А 260/А 280= 2, 31.

Блот гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ. Одним из эффективных методов идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является блот гибридизации. Суть метода – рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического

радиоактивно меченым ДНК или РНК зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот гибридизация – высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. При длительной экспозиции (в течение нескольких дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК зонда этот метод позволяет выявлять следовые ДНК. Так, при использовании зонда размерами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 1000 п. о. может быть выявлена в 10 мкг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на авторадиографе после его экспозиции в течение 12 ч. Метод позволяет работать и с очень короткими олигонуклеотидными зондами (20

Гибридизация с меченым ДНК зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза дот или слот гибридизации в зависимости от конфигурации пятна на фильтре – округлой или продолговатой. Методом гибридизации ДНК зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозен блот, тогда как Вестерн блот, или иммуноблот, это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с меченными антителами. Название этих методов – в честь молекулярных генетиков проф. Э. Саузерна.

Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизация in situ.

Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (fluorescein in situ hybridization). Меченый ДНК зонд наносят на препараты дифференци ально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатуриро ванных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК.

Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих процедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин или флюоресцеин меченых ДНК зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использо ванному ДНК зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определенных хромосом.

Гибридизация in situ выявляется одним из наиболее эффективных мето дов картирования комплементарных ДНК зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутрихромосомной локализации уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК зонды.

Гибридизация in situ между молекулами РНК и к. ДНК зондами проводится на гистологических препаратах и является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации м. РНК. Рис. 4. Экспрессия Ki 67 в ядрах опухолевых клеток при аденокарциноме желудка. Ув. 200. Окр. : иммуногистохимическая реакция с докраской гематоксилином Майера.

Рис. 5 Экспрессия Bcl 2 в цитоплазме клеток инфильтрирующих строму опухоли при аденокарциноме желудка. Ув. 200. Окр. : иммуногистохимическая реакция с докраской гематоксилином Майера. Рис. 6 Экспрессия Р 57 в ядрах опухолевых клеток и в ядрах клеток инфильтрата при аденокарциноме желудка. Ув. 200. Окр. : иммуногистохимическая реакция с докраской гематоксилином Майера.