ВВЕДЕНИЕ В ЛЕСНУЮ БИОТЕХНОЛОГИЮ Шестибратов Константин Александрович

Потребность в древесине к 2020 году увеличится на 20 %

Ежегодно площадь лесов сокращается на 9. 4 млн га

Должен установиться баланс лесопосадка лесозаготовка

? Что необходимо ?

Уровень развития сельского хозяйства 10 000 лет назад Доместикация Селекционная революция 1995 год Биотех революция Сегодня!

Уровень развития лесного хозяйства 10 000 лет назад Доместикация Селекционная революция 1995 год Биотех революция Сегодня!

Ключевые критерии плюсовой селекции лесных пород Симметричная крона Сильный апикальный рост Слабое ветвление Осевой ствол до апикальной части кроны Естественное опадание сучьев Минимальная кривизна ствола МАКСИМАЛЬНЫЙ ЗАПАС ДРЕВЕСИНЫ

Традиционные методы селекции Культура клеток, тканей и органов in vitro Молекулярное маркирование Генная инженерия

Не генно-инженерные • Плюсовая селекция (ПС) • ПС + молекулярное маркирование (ММ) • ПС + микроклонирование (МК) • ПС + ММ+ МК • Соматическая полиплоидизация (СП) • СП + МК Генноинженерные • ПС + Генетическая трансформация (ГТ) • ГТ + МК • ПС + ММ + ГТ + МК

Молекулярное маркирование Плюсовые формы Природная популяция Фенотип Молекулярные маркеры Генотип Улучшенные формы Генетический анализ

Спектр решаемых задач Молекулярное маркирование Сертификация семенного фонда Интенсификация селекционной работы Паспортизация селекционных достижений

Преимущества: q Исключается риск высадки нерайонированного посадочного материала q Возможность унификации данных сертификации для создания информационной базы данных объектов ЕГСК q Отбор элитных форм проводится по генотипу, что обеспечивает наследуемость признаков q Высокая производительность q Возможность проведения направленного скрещивания q Защищенность селекционных достижений от нелицензированного использования q Возможность проведения независимой экспертизы генетической ценности селекционных достижений

Культура in vitro клеток, тканей и органов растений исходное растение стерилизация омоложение мультипликация регенерация адаптация укоренение

Отбор плюсовых форм и получение асептических культур in vitro Поиск ценных форм Получение асептических культур Отбор эксплантов

Омоложение и микроразмножение асептической культуры in vitro Основные проблемы этой стадии: • Витрификация • Некроз • Низкий коэффициент мультипликации • Низкая частота укоренения

Оптимизация условий культивирования Мультипликация и элонгация Укоренение

Клональное микроразмножение маточных растений

Спектр решаемых задач: Оздоровление посадочного материала Культура растений In vitro Массовое размножение элитных генотипов Депонирование In vitro Создание новых продуктивных форм Сохранение лесных генетических ресурсов

ги охр бр а ид нен ны ие х св ой Вы ст пр со в ои ка зв я од ит ел Ни ьн се зк ос бе ая ть ст ои мо ст ь Сравнение способов размножения: Способ размножения в ро о зд О С е ни ле ü Черенкование ü Семенное Микрочеренкование ü ü ü Искусственные семена ü ü ü

Методы генетической трансформации Физические Микроинъекция Давление Бомбардамент Электропорация Кремниевые/ углеродные иглы Лазерный метод Ультразвуковой Химические Биологические PEG DEAE-dextran Фосфат кальция Липиды A. Tumefaciens A. Rhizogenes Вирусный In planta

Агробактериальная трансформация Трансгенное Траснгенное растение Целевой ген Agrobacterium tumefaciens вектор Перенос ДНК Трансгенная клетка Регенерация

Этапы трансформации Клонирование целевого гена Конструирование векторной плазмиды Агробактериальный перенос Селекция трансгенных клеток и тканей и элиминация бактерий Регенерация растения Подтверждение трансгенного статуса

Разработка методики регенерации адвентивных побегов и селекции трансформантов • Тип экспланта • Состав питательной среды • Тип и концентрация селективного агента • Эффективность регенерации канамицин + канамицин -

Стадия агробактериального переноса

Регенерация трансгенных побегов Контроль + Контроль - Трансформанты Эффективность трансформации зависит от • Частоты регенерации адвентивных побегов • Гистологических особенностей регенерации • Процедуры инокуляции и вирулентности штамма • Частоты агробактериального переноса • Эффективности процесса селекции

Подтверждение трансгенного статуса • Выявление всевдотрансформантов • Укоренение на селективной средеё • Оценка агробактериальной контаминации • ПЦР анализ • Анализ экспрессии гена Осина, GUS + ПЦР анализ 1 – вода, 8 -23 – трансгенные линии березы, m – маркер (100 bp), бб 31 – нетрансгенный контроль

Основные направления генетического улучшения Количество биомассы • Скорость роста • Слабое ветвление • Компактная корневая система • Минимальная кривизна ствола Агрономические характеристики • Устойчивость к вредителям и болезням • Устойчивость к засухе • Устойчивость к гербицидам • Компактная корневая система Качество древесины n n n Лигнины Целлюлоза Гемицеллюлоза Содержание влаги Длина древесного волокна Биобезопастность n Блокирование цветения

Степень внедрения биотехнологий в лесном секторе по странам

Технологии культуры in vitro растений FAO, Preliminary review of biotechnology in forestry (2005): 82 рода лесных древесных растений. Половина всех работ приходится на пять родов: Pinus, Picea, Eucalyptus, Acacia, Quercus. Соматический эмбриогенез - 65%, стеблевая культура -13%.

Генетическая трансформация древесных пород FAO, Preliminary review of biotechnology in forestry (2005): 35 стран проводят генетическую трансформацию 29 родов лесных древесных растений Род Populus - почти половина всех ГМ работ

Модельное дерево лесной биотехнологии • • Тополь это арабидопсис лесной биотехнологии Виды рода тополь (Populus) — модельные виды для изучения генетики и культивирования древесных растений. Имеют небольшой размер генома и быстрый рост, разработана методика трансформации. Полностью секвенирован геном североамериканского вида Populus trichocarpa Размер генома Арабидопсис – 100 -150 Мвр Сосна – 20 000 Populus/Salix – 450 -550 Мвр

Трансгенный тополь с геном Bt-токсина (Китай) Создан в 2003 году. Первая коммерческая плантация общей площадью заложена в 2008 году. Заявили о планах заложить к 2012 17 млн. га. Результат коллаборации с Германией Семена не прорастают

Высокопродуктивный эвкалипт (Бразилия) Ротационный период 5 -7 лет Прирост достигает 120 куб. м. /га/год

Эвкалипт устойчивый к заморозкам (США) Май 2010 года В 7 штатах США заложено суммарно 120 га трансгенного эвкалипта. Есть гибриды не ГМ устойчивые к заморозкам, однако они растут на 40 -60 % медленнее! Они стерильные – не дают пыльцы!! Главная цель – получать из биомассы целлюлозный этанол.

Полиплоидная пауловния (США, Индия) • • • Полиплоидизация увеличила скорость роста на 50 -60% Размножается в культуре in vitro Ротационный период 5 лет (фото справа)

Полевые испытания ГМ деревьев FAO, Preliminary review of biotechnology in forestry, 2005. Число зарегистрированных полевых испытаний с Страна Основные свойства ГМ деревьев: 1 - Устойчивость к гербицидам 2 - Устойчивость к вредителям и болезням 3 - Повышенная скорость роста 4 - Модификация лигнинов Австралия 1 2 Бразилия 2 1 7 0 Чили 3 0 Китай 9, коммерческий статус 0 Финляндия 5 0 Франция Среди лесных ГМ пород: Pinus, Picea, Eucalyptus, Populus, Betula плодовыми и декоративными культурами Канада 1988 – первые полевые испытания ГМ лесной породы (Бельгия). лесными породами 4 0 Германия 4 1 Индия 1 0 Индонезия 1 0 Новая Зеландия 3 3 Норвегия 1 0 Португалия 1 0 ЮАР 1 0 Испания 1 0 Великобритания 6 2 США 103 47 Россия 0 8 Всего 155 64

Экономическая эффективность биотех инноваций (Sedjo, 2005) Инновация Эффективность Срок окупаемости Клонирование элитных генотипов сосны Повышение продуктивности на 20 -30 % в возрасте 20 лет Молекулярное маркирование и клонирование генетически уникальных генотипов эвкалипта Повышение продуктивности на 100 %. Ротационный период сокращен до 8 -10 лет. 10 лет Устойчивость к гербицидам (эвкалипт, Бразилия) Снижение расходов по уходу в первые годы на $350 или до 45% на га в год. 1 -3 года Устойчивость к вредителям Снижение расходов на пестициды и сохранение продуктивности 1 -10 лет Улучшение качества древесинного волокна Снижение расходов при измельчении – до $10 на m 3 10 -40 лет Снижении доли ювенильной древесины Увеличение доли товарной древесины $15 на m 3 10 -40 лет Снижении доли лигнинов Снижение расходов на делигнификацию на $15 на m 3 10 -40 лет Повышение плотности древесины Повышение качества древесины 10 -40 лет

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!