ВВЕДЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКУЮ МИКРОБИОЛОГИЮ Лектор ЛЕВАНОВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

ВВЕДЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКУЮ МИКРОБИОЛОГИЮ Лектор: ЛЕВАНОВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА д. м. н. , зав. кафедрой микробиологии, иммунологии и вирусологии Кемерово, 2012

Лаборатория: определение n Это учебное, научное или производственное учреждение (или его подразделение), выполняющее экспериментальные, контрольные или аналитические исследования.

Виды лабораторий: Клинико-диагностические лаборатории общего или специального типов, входящие в состав ЛПУ; n Базовые лаборатории Министерства здравоохранения и службы Роспотребнадзора : - бактериологические, - санитарно-химические, n Научно-исследовательские лаборатории ВУЗов и НИИ; n Специализированные лаборатории; n

Классификация микроорганизмов по группам патогенности n n 1 группа – возбудители особо опасных инфекций (Y. pestis, Filoviridae, Arenaviridae) 2 группа – возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний (B. anthracis, B. abortus, V. cholerae) 3 группа – возбудители инфекционных заболеваний, выделяемых в самостоятельные нозогруппы (C. diphtheriae, B. pertussis, S. paratyphi) 4 группа – условно-патогенные бактерии (S. epidermidis, E. faecalis)

Категории микробиологических лабораторий 1. 2. 3. Базовые (общего типа или основные), Режимные (изолированные) Лаборатории особого режима (максимально изолированные)

Общие требования к забору и транспортировке материала Вид материала должен соответствовать локализации предполагаемого возбудителя; n Количество материала должно быть достаточным; n Материал забирают до начала антимикробной терапии, непосредственно из очага инфекции или исследуют отделяемое; n

Общие требования к забору и транспортировке материала n n n Необходимо исключить контаминацию материала нормофлорой пациента и микробами окружающей среды, для чего материал берут в асептических условиях при адекватном доступе; Забор осуществляется стерильным инструментом в стерильную посуду; Любой материал должен рассматриваться как потенциально опасный, поэтому при заборе материала должны использоваться СИЗ;

Общие требования к забору и транспортировке материала n n Транспортировка в лабораторию должна осуществляться в максимально короткие сроки (оптимально в течении 2 часов) в изотермических контейнерах, предохраняя от света, механических повреждений. Хранить в холодильнике не более 24 часов (кроме ликвора); К материалу прилагают сопроводительный документ.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

5 методов микробиологической диагностики Микроскопический n Бактериологический n Биологический n Серологический n Аллергологический n

Методы исследования: микроскопический Основан на непосредственном обнаружении микробов в материале. Позволяет изучить: n морфологические и тинкториальные свойства (фиксированные препараты), n морфологию и подвижность (в нативных препаратах)

Leptospira interrhogans Treponema pallidum в темном поле (темнопольная микроскопия нативного препарата)

Borrelia recurrentis (окраска по Романовскому – мазок крови)

Mycobacterium leprae (в окраске по Цилю. Нильсену) Treponema pallidum (в окраске по Морозову)

Neisseria gonorrhoeae (окраска по Граму)

Ограничения микроскопического метода n n n Не возможно идентифицировать бактерии до вида по морфологии и тинкториальным свойствам Не возможно судить о количестве микробов в материале, их свойствах Нельзя использовать, если материал получен из биотопа, изначально содержащего нормальную микрофлору

Методы исследования: культуральный (бактериологический) Основан на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации. Позволяет определить: n видовую или родовую принадлежность микроба n чувствительность к антибиотикам Играет решающее значение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний

Диагностическая ценность микробиологических методов n n Культуральный является «золотым стандартом» , ведущим методом, позволяет: Выделить Идентифицировать микроб, Изучить его биологические свойства и чувствительность к антимикробным препаратам

Методы исследования: биопробы Основаны на неодинаковой чувствительности лабораторных животных к микробам. Применяют для: n выделения чистых культур, если микробы плохо растут или не растут на питательных средах; n изучения вирулентности бактерий.

Ограничения биологического метода n К большинству возбудителей антропонозных инфекций лабораторные животные невосприимчивы

Методы исследования: аллергологический n Основаны на выявлении гиперчувствительности к инфекционным антигенам (аллергены) при некоторых заболеваниях: туберкулеза, бруцеллеза, туляремии и др.

Ограничения аллергологического метода n n Большинство микробов, попадая в организм человека не вызывают ГЗТ; Не позволяют дифференцировать заболевание от поствакцинальной аллергии;

Диагностическая ценность микробиологических методов исследования Микроскопический аллергологический и биологический методы имеют низкую информативность и являются дополнением к культуральному методу

Методы исследования: серологические Основаны на обнаружении феномена взаимодействия антигена с антителом. Применяют для: n поиска антител в сыворотке крови больного или определения динамики их нарастания n изучения антигенной структуры микроорганизмов при идентификации

При серологических реакциях учитывают: n n Диагностический титр - такое разведение исследуемой сыворотки, начиная с которого положительная реакция имеет диагностическое значение. Нарастание титра антител – устанавливается при исследовании парных сывороток, взятых от больного в разные сроки болезни с интервалом 5 -7 дней. Диагностическое значение имеет нарастание титра в 4 и более раз

Диагностическая ценность микробиологических методов исследования n Второе место по информативности занимает серологический метод, т. к. взаимодействие антитела с антигеном характеризуется высокой специфичностью

Классификация серологических реакций (по количеству компонентов): Простые (двухкомпонентные, осадочные)-протекают в 2 фазы: n Иммунологическая – происходит взаимодействие антигена с антителом с выделением тепла n Физико-химическая – комплекс «антигенантитело» , образовавшийся в первой фазе, укрупняется и выпадает в осадок.

Примеры простых серологических реакций

Классификация серологических реакций (по количеству компонентов) Сложные (многокомпонентные) – для выявления комплекса «антиген-антитело» вводят индикаторные системы или известный компонент, помеченный различными метками

Примеры сложных серологических реакций

Молекулярно-генетические методы исследования n n n Позволяют обнаружить в образцах нуклеиновые кислоты возбудителя (НК). Они высокоспецифичны, что обусловлено индивидуальностью геномов организмов и применении принципа комплементарности, т. е. соответствия другу нуклеотидных пар (А-Т; ГЦ) Включают ПЦР (полимеразную цепную реакцию), секвенирование ДНК, молекулярная гибридизация

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Цели n обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры n идентификация микроорганизмов n генотипирование микроорганизмов

ПЦР n n Суть- циклическое удвоение (амплификация) определенного участка ДНК с помощью праймеров. Увеличение количества копий идет в геометрической прогрессии.

Ингредиенты реакции: n n n Исследуемая ДНК; 2 праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой ДНК; Нуклеотиды 4 видов; Термостабильная полимераза (от Thermus aquaticus) Буферная смесь

Этапы ПЦР n n n «Плавление» – смесь за 1 мин прогревают при 94 С, комплементарные ДНК разъединяются «Отжиг» - t снижают до 45 -65 С и выдерживают ее 1 -1, 5 мин. К одноцепочечной ДНК присоединяется праймеры «Элонгация» - t 72 С, она оптимальна для работы фермента, который используя нуклеотиды из смеси достраивает комплементарные нити, начиная с 3 -концов Рабочее место при проведении ПЦР и термоциклер (амплификатор)

Детекция амплифицированной ДНК n В агарозном геле с помощью электрофореза; n По флюорисценции в автоматическом режиме;

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ Цель Выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ Принцип осуществления исследуемая ДНК нагрев в щелочной среде расплетение на две отдельные нити закрепление одной из них на специальном фильтре помещение этого фильтра в р-р, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом) понижение температуры + - восстановление двойной спирали – - двойная спираль не восстанавливается

Секвенирование ДНК n Позволяет определить последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК

Этапы секвенирования n n n 1. С помощью ПЦР накапливают достаточное количество копий исследуемого участка ДНК 2. Молекулы ДНК с помощью щелочного гидролиза разрезают на фрагменты различной длины 3. Добавляют дидезоксинуклеотиды, каждый из которых помечен определенным красителем и присоединяется к комплементарным нуклеотидам на 3 -конце каждого фрагмента

Этапы секвенирования n 4. Смесь полученных меченных фрагментов ДНК подвергается электрофорезу в геле. Первыми будут двигаться фрагменты, имеющие наименьшую молекулярную массу (1 нуклеотид), вторыми мимо оптического датчика пройдут ДНК в 2 нуклеотида. Результаты обрабатываются автоматически

СТРЕПТОКОККИ Обнаружены: Билротом (1874 г. ), Пастером (1879 г. ), Огстоном (1881 г. ) Выделены в чистом виде: Феляйзеном (1883 г. ), Розенбахом (1884 г. )

Стрептококки: таксономическое положение n n n Домен Тип Класс Порядок Семейство Род Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Streptococcaceae Streptococcus

Стрептококки: свойства Морфологические овальные грамположительные кокки, располагающиеся в мазке цепочками, спор и макрокапсул не образуют, неподвижны n Культуральные растут на сложных средах (содержащих глюкозу, сыворотку или кровь) при 370 С, образуют через сутки мелкие S-формы колоний n Биохимические = стафилококки, но менее выражена протеолитическая активность n Серологические n 1. 2. n полисахаридные (групповые) антигены – полисахарид КС белковые типоспецифические антигены (чаще всего для серологической идентификации используется М-белок, по нему различают около 100 сероваров) Резистентность во внешней среде – высокая

Стрептококки Классификации n По полисахаридному антигену (в РП) (R. Lancefield) подразделяют на 20 серогрупп (A – V), а также группу зеленящих стрептококков. Серогруппы состоят из сероваров, различающихся белковыми антигенами (М-белок, Т-белок, F-белок).

Стрептококки: классификации n По способности вызывать гемолиз на МПА с кровью барана: ¨ -гемолитические – разлагают гемоглобин до метгемоглобина, вызывая появление вокруг колонии узкой зеленой каемки (из-за чего называются еще зеленящими стрептококками). ¨ -гемолитические – вызывают полный гемолиз (широкая зона просветления вокруг колоний). В большинстве своем относятся к серогруппе А играют основную роль (среди других стрептококков) в патологии человека, серогруппам В, С, F, G. ¨ -гемолитические стрептококки не образуют на агаре с кровью барана визуально видимых зон гемолиза.

Стрептококки: классификации n по экологическому критерию: ▪ антропонозы – S. agalactiae, S. anginosus, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. mutans, S. salivarius, S. sangvis (около 30 видов) ▪ зоонозы – S. bovis, S. canis, S. suis, S. rattus (около 9 видов) ▪ сапронозы - S. shiloi Не имеют медицинского значения для человека около 35 видов стрептококков.

Стрептококки: классификации на основании патогенности ▪ истинные патогены – S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes, (III группа патогенности) ▪ условные патогены - S. sangvius, S. milleri, S. dysgalactiae, S. mitis, S. gallinaceus, S. massiliensis, S. iniae (IV группа патогенности) ▪ оппортунистические патогены - S. mutans, S. salivarius, S. slivarius, S. oralis, S. vestibularis, S. bovis, S. suis и др. (IV группа патогенности) n

Стрептококки: свойства n Факторы патогенности ¨ Пили n М-белок (адгезия, угнетение фагоцитоза, суперантиген) n F-белок (прикрепление к эпителиальным клеткам) ¨ Ферменты n стрептокиназа (гидролиз фибрина) n аминопептидаза (угнетает хемотаксис фагоцитов) n гиалуронидаза (обуславливает инвазию) n ДНК-аза (стрептодорназа) ¨ Белковые токсины n стрептолизины О и S n цитотоксин (у нефритогенных стрептококков) n эритрогенин (у скарлатинозного стрептококка – пироген и аллерген)

СТРЕПТОКОККОВЫЕ ИНФЕКЦИИ S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes вызывают болезни, имеющие самостоятельную рубрику в МКБ-10

Стрептококковые инфекции n n n Эпидемиология ¨ источники инфекции: животные, человек (больной, носитель) ¨ механизмы передачи: аэрогенный (основной), контактный (дополнительный) Патогенез ¨ обусловлен действием факторов вирулентности Иммунитет ¨ антитела к М-антигену обуславливают прочный и длительный, но типоспецифический иммунитет ¨ антитоксические антитела при скарлатине обеспечивают прочный и длительный иммунитет Профилактика ¨ неспецифическая – предупреждение хронизации процесса ¨ специфическая – не разработана Этиотропная терапия ¨ пенициллины (к ним у стрептококков устойчивость не развивается)

Стрептококковые инфекции Наибольшую роль в патологии человека играют гемолитические стрептококки группы А, относящиеся к Streptococcus pyogenes, вызывающие гнойно-воспалительные заболевания: - фарингит - ангину - импетиго - пневмонию негнойные инфекционно-аллергические заболевания: - ревматизм - рожу - скарлатину - острый гломерулонефрит Стрептококки группы В – Streptococcus agalactiae вызывают: заболевания новорожденных (инфекции дыхательных путей, менингит, септицемию); Стрептококи группы D – энтерококки вызывают: раневые инфекции, различные хирургические заболевания, гнойные осложнения у беременных, родильниц и гинекологических больных, инфицируют почки, мочевой пузырь, вызывают сепсис, эндокардит, пневмонии, пищевые токсикоинфекции.

Стрептококковые инфекции n Клинические проявления

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций

ПНЕВМОКОКК Streptococcus pneumoniae Выделил Л. Пастер (1881 г. )

Пневмококк: свойства морфологические: ланцетовидные грамположительные кокки, располагающиеся в мазке попарно, спор не образуют, характерная черта - макрокапсула, неподвижны n культуральные: растут на сложных (содержащих кровь или сыворотку + 0, 1% глюкозы) питательных средах при 370 С, образуют через сутки мелкие S-колонии с α-гемолизом n биохимические: умеренно выражены, характерно ферментация инулина n серологические: по К-антигену (полисахарид капсулы) подразделяется на более 80 сероваров n факторы патогенности 1. капсула, 2. субстанция С (тейхоевая кислота КС) n резистентность во внешней среде не устойчивы n

Пневмококковые инфекции n n n Эпидемиология ¨ источник инфекции: больные, носители (до 50% детей дошкольного возраста, до 25% взрослых) ¨ механизмы передачи: аэрогенный (воздушно-капельный, особенно при вспышках), контактный ¨ предрасполагающие условия: снижение резистентности, на фоне др. патологии, алкоголизм Клинические проявления ¨ пневмония, менингит, ползучая язва роговицы, поражения других органов Иммунитет ¨ типоспецифический (антитела к К-антигену) Профилактика ¨ неспецифическая – мероприятия, направленные на предупреждение возникновения эндогенной инфекции ¨ специфическая – поливалентная химическая вакцина (группам риска) Этиотропная терапия ¨ антибиотики (по результатам антибиотикограммы)

Пневмококковые инфекции n Патогенез

Микробиологическая диагностика пневмококковой инфекции

МЕНИНГОКОКК Neisseria meningitidis Открыл Вайхзельбаум (1887 г. )

Менингококк: свойства морфологические: бобовидные грамотрицательные кокки, располагающиеся в мазке попарно, спор не образуют, образуют с трудом обнаруживаемую макрокапсулу, неподвижны n культуральные: растут на сложных (содержащих большое количество белка, например сывороточных) питательных средах при 370 С (лучше – при повышенном СО 2), образуют через 2 -3 суток мелкие S-колонии биохимические: оксидаза (родовой признак), ферментируют до кислоты глюкозу и мальтозу (видовой признак) n резистентность во внешней среде очень низкая n

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА МЕНИНГОКОККОВ По капсульным антигенам выделяют 13 серогрупп (А, В, С, Д и т. д. ): Штаммы серогруппы А вызывают эпидемические вспышки Штаммы серогрупп В, С, Y – спорадические случаи По белкам наружной мембраны (поринам А, В) и ЛОС выделяют серотипы (в серогруппах B, C, Y, W) Серотипирование применяют в эпидемиологическом анализе для слежения за закономерностями распространения менингококковой инфекции

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ МЕНИНГОКОККОВ Пили и Opa-белки – факторы адгезии Ig. A-протеаза – разрушает антиадгезивные антитела, способствуя прикреплению. Гиалуронидаза и нейраминидаза – ферменты инвазии Полисахаридная капсула – предохраняет от фагоцитоза и лизиса комплементом. Играет патогенетическую роль только при попадании менингококков во внутреннюю среду макроорганизма. На слизистых «мешает» адгезии, поэтому гены, ответственные за синтез капсульного полисахарида включаются только после инвазии микроба в ткани и кровь.

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ МЕНИНГОКОККОВ Липоолигосахарид очень токсичен, что связано со структурными особенностями: состоит из липида А и Cor-углевода, отсутствуют боковые углеводные радикалы. Это обеспечивает более высокую доступность липида А и более легкое связывание с клетками-эффекторами. Высвобождение происходит при аутолизе или при комплементзависимом бактериолизе

Менингококковая инфекция n Эпидемиология ¨ источник инфекции: человек в 70 -80% случаев – носители n в 10 -30% случаев – больные менингококковым назофарингитом n в 1 -3% случаев – больные генерализованными формами менингококковой инфекции n ¨ механизм передачи – аэрогенный (воздушно -капельный путь)

Менингококковая инфекция n n Клинические проявления 1. бактерионосительство 2. менингококковый назофарингит 3. менингококкцемия 4. эпидемический цереброспинальный менингит Иммунитет ¨ обусловлен комплементсвязывающими антителами против капсульных полисахаридов (постинфекционный – перекрестный) Профилактика ¨ неспецифическая – соблюдение санитарно-противоэпидемического режима в дошкольных, школьных учреждениях и местах постоянного скопления людей ¨ специфическая – химическая вакцина (полисахариды групп А и С) Этиотропная терапия ¨ антибиотики (по результатам антибиотикограммы) и сульфаниламиды

ФОТОГРАФИЯ БОЛЬНОГО МЕНИНГОКОККЕМИЕЙ

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЗВЕНЬЯ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ Попадание на слизистую носоглотки и выделение Ig A протеаз Адгезия с помощью Pil. C к рецепторам CD 46 Активация адгезии с помощью Opa-белков на CD 66 (здоровое носительство) Инвазия путем трансцитоза в субэпителиальное пространство (назофарингит) Выделение гиалуронидазы и нейраминидазы Попадание в кровеносное русло или на оболочки мозга Размножение и эндотоксемия (генерализованная менингококковая инфекция)

Менингококковая инфекция n Патогенез

ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ Материал для исследования (при цереброспинальном менингите) – кровь и ликвор Материал отбирают до начала антибактериальной терапии Объем забираемого материала: ликвор – не менее 5 мл, кровь – 10 -15 мл

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: Ориентировочные – бактериоскопический Основной – бактериологический Экспресс-методы – серологический (поиск АГ менингококка): латекс-агглютинация, встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ), ИФА, ПЦР. Вспомогательные – серологический (серодиагностика)

БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД Мазок из ликвора и препарат «толстая капля» окрашивают водно-спиртовым р-ром метиленового синего. В мазках полинуклеарные лейкоциты, нити фибрина и бобовидной формы диплококки внутри и вне лейкоцитов.

СЕРОДИАГНОСТИКА МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ С парными сыворотками в РНГА: 1 сыворотка на 1 день болезни 2 сыворотка на 10 -12 день болезни Четырехкратное нарастание титра антител, начиная с 1: 40 служит подтверждением диагноза

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА: Вакцина менингококковая групп А и С полисахаридная сухая – субклеточная. Представляет очищенные капсульные специфические полисахариды N. meningitidis серогрупп А и С. Иммунизируют детей старше 1 года, подростков и взрослых в очагах менингококковой инфекции, вызванной серогруппами А или С. В России зарегистрированы зарубежные вакцины: 1) вакцина менингококковая А+С (Менинго А+С) (Франция); 2) вакцина менингококковая В+С (VA-MENGOC-BC) (Куба); Поствакцинальный иммунитет у детей сохраняется не менее 2 лет, а у взрослых – до 10 лет.

Благодарю за внимание!