Возбудители анаэробных инфекций СПб ГУ 2015 План

Возбудители анаэробных инфекций СПб. ГУ 2015

План лекции • • • 1. Особенности анаэробных инфекций 2. Отличие анаэробных и аэробных МО 3. Классификация МО по степени толерантности к О 2 4. Клинически значимые анаэробные МО 5. Характеристика Рода Clostridium 6. Возбудители газовой гангрены 7. Вид C. perfringens 8. Вид C. botulinum 9. Ботулотоксин 10. Вид Clostridium tetani

Газовая гангрена некроз мягких тканей

Вопрос 1. Особенности анаэробных инфекций • Анаэробная инфекция – эндогенная и экзогенная инфекция, обусловленная развитием анаэробных микроорганизмов • Экзогенная (раневая) анаэробная инфекция развивается при попадании в макроорганизм при травмах и ожогах анаэробных споровых бактерий из внешней среды. • Эндогенная анаэробная инфекция возникает в результате проявления патогенных свойств анаэробными бактериями, входящими в состав нормальной микрофлоры человека.

Вопрос 2. Отличие анаэробных и аэробных МО • Анаэробы: чувствительны к действию активных форм кислорода • погибают в присутствии свободных радикалов кислорода • нет ферментов цитохромной цепи (супероксиддисмутазы (СОД), каталазы) • могут использовать в качестве питательных субстратов органические вещества (углеводы и белки), но в отсутствие кислорода • свойственно брожение или бескислородный тип дыхания

Ферменты цитохромной цепи (СОД, каталаза) 2 О 2 - +Н 2 2 Н 2 О 2 СОД каталаза Н 2 О 2 + О 2 ↑ 2 Н 2 О+О 2↑

Типы брожения Брожение – процесс разложения глюкозы под действием ферментов МО с расщеплением углеродных связей. • Спиртовое (дрожжевые клетки) • Маслянокислое (Clostridium • pasteurianum, C. botulinum), • Молочнокислое (Lactobacillus), • Пропионовокислое (род Propionibacterium) • и др.

Типы бескислородного дыхания • В результате дыхания происходит расщепление сложных молекул до простых с выделением энергии, которая запасается в молекулах АТФ. • Процесс дыхания – это реакция окисления углеводов, которая может происходить в присутствии кислорода – аэробный тип дыхания (окислительное фосфорилирование), • И в бескислородных условиях – анаэробный тип дыхания или гликолиз. • Тип дыхания: • Cульфатный • Нитратный • Нитритный • Фосфатный • В этих случаях акцептором ĕ служит не О 2 (как при кислородном дыхании), а сульфаты, нитриты и фосфаты.

Вопрос 3. Классификация анаэробов по степени толерантности к О 2 • 1. Строгие (облигатные) анаэробы – погибают в течение 1 мин при наличии в среде свободных радикалов О 2. Не растут, если среда содержит 0, 5% О 2 (напр. метановые бактерии). • 2. Аэротолерантные микроорганизмы – выдерживают 1 час при концентрации О 2 0, 1% (напр. Clostridium perfringens).

Классификация анаэробов (продолжение) • 3. Умеренные анаэробы или микроаэрофилы. Выживают при содержании О 2 2 -8%, когда О 2 меньше, а СО 2 больше - 5 -10%. (напр. р. Brucella). • 4. Факультативные анаэробы – растут в присутствии О 2 и без него. Для устранения свободных радикалов О 2 включают систему цитохромной цепи, образуется каталаза и СОД (напр. все энтеробактерии). • 5. Аэробы – только кислородное дыхание (напр. Bacillus, Leptospira).

Вопрос 4. Клинически значимые анаэробные бактерии Бактерии Bacteroides fragilis Bacteroides Расположение в организме хозяина Гр (-) палочки толстая кишка Споры ротовая полость - толстая кишка, ротовая полость - - melaninogenicus Fusobacterium

Гр (+) палочки Actinomyces Lactobacillus ротовая полость толстая кишка, вагина - Bifidobacterium Propionibacterium Eubacterium толстая кишка Кожа ротовая полость, толстая кишка - Arachnia ротовая полость, толстая кишка - Clostridium ротовая полость, толстая кишка, вагина +

Гр (-) кокки Veillonella ротовая полость, толстая кишка -

Гр (+) кокки Peptococcus ротовая полость, толстая кишка - Peptostreptococc us ротовая полость, толстая кишка -

2 группы анаэробов • по принципу спорообразования, т. к. , в основном, главными возбудителями всех экзогенных гнойно-воспалительных инфекций являются спорообразующие – представители рода Clostridium.

Вопрос 5. Характеристика Рода Clostridium • Заболевания: газовая гангрена, столбняк, ботулизм, псевдомембранозный энтероколит, некротический энтерит • Нормальная микрофлора: ротовая полость, ЖКТ, вагина • Выделяют: 30 видов при ранениях, ожогах, ампутациях и операциях

Род Clostridium (150 видов) 1. C. perfringens – 2. C. tetani 3. C. botulinum 4. C. septicum 5. C. sordellii 6. C. novyi 7. C. difficile выявляют в 80% случаев

Смешанные анаэробные инфекции • ПОЛИКУЛЬТУРЫ: • смесь клостридий разных видов • клостридии и неспорообразующие анаэробы • неспорообразующие анаэробы и факультативные анаэробы

Морфологические свойства клеток р. Clostridium • • • крупные Гр+ палочки ширина 0, 6 -0, 9 мкм длина 4 -9 мкм образуют эндоспоры при глубоком анаэробиозе все клостридии подвижны, кроме C. perfringens (не имеет жгутиков)

Локализация спор р. Clostridium • А -- C. tetani ( «барабанные палочки» ) Б -- C. perfringens (различная локализация) B -- C. botulinum ("теннисные ракетки")

Культуральные свойства клеток р. Clostridium Питательные среды: Кровяной анаэробный агар с глюкозой Среда Кита-Тароцци 1 2 3 1. Clostridium perfringens 2. Clostridium sporogenes 3. Контроль (незасеянная среда) Среда Кита – Тароцци. Признаки роста - помутнение и газообразование. Показатели протеолиза - почернение и распад кусочков мяса

Культуральные свойства клеток р. Clostridium 1. Незасеянная среда 2. Clostridium perfringens 3. Clostridium sporogenes 1 2 3 Среда для культивирования сульфитредуцирующих клостридий. Дифференциация происходит на основании способности редуцировать сульфит до сульфида, который с ионами железа образует черный преципитат.

Вопрос 6. Возбудители газовой гангрены • Газовая гангрена развивается при попадании спор Clostridium в некротизирующуюся ткань. • Окислительно-восстановительный потенциал (Eh) такой ткани имеет отрицательный заряд.

Окислительно-восстановительный потенциал (Eh) • Eh некротизирующейся ткани - 160 -180 m. V (микровольт) • Eh нормальной ткани +150 m. V • Редукторы кислорода (тиогликолевая кислота, хлористый цистеин, аскорбиновая кислота) снижают Eh до -100 m. V • Краситель-индикатор ризорцин обесцвечивается при Eh - 60 m. V

Культивирование анаэробов в микроанаэростатах Контейнер для чашек Петри микроанаэростат

Патогенез газовой гангрены • Развивитие спор Clostridium происходит в некротизирующейся ткани, где: • 1. отрицательные значения Eh • 2. ферментация углеводов • 3. образуются газы, некротизирующий токсин, гиалуронидаза, ДНК-аза, протеиназы • 4. расширение зоны некроза → токсинемия →летальный исход • 5. Больного может спасти только специфическая антитоксическая сыворотка!!!

Клинические проявления клостридиальной инфекции • • 1. некроз ткани 2. токсинемия 3. кишечные инфекции 4. пищевые отравления 5. некротический энтерит 6. целлюлит 7. воспаление оболочек мышечных тканей и сосудов 8. колонизация сердечной мышцы, клапанов → эндокардит

Вопрос 7 Вид C. perfringens Морфологические свойства клеток • Длина клеток до 8 мкм • Клетки образуют нити до 140 мкм образуют субтерминальные овальные эндоспоры на щелочных средах с белками • Неподвижны!!!!!!!

Культуральные свойства C. perfringens • Опт. Тº 35 -37ºС • р. Н 7, 2 -7, 4 • Через 2 -4 ч в ЖПС бурное газообразование, токсинообразование • Колонии 2 -5 мм с зоной гемолиза

Культуральные свойства C. perfringens клеток R-форма колоний

Биохимические свойства C. perfringens • 1. ферментируют все сахара с образованием кислоты и газа • 2. пептонизируют молоко • 3. слабая протеолитическая активность • (разжижают желатину) • 4. растут на 20% желчи и на 2% Na. Cl, • 5. не растут на 6, 5% Na. Cl

АГ свойства, патогенность и токсинообразование C. perfringens • • Образуют множество экзотоксинов: 1 - главные токсины 2 - минорные токсины Токсины обладают АГ- специфичностью

5 серотипов C. perfringens на основании АГспецифичности главных экзотоксинов Главные экзотоксины Серотипы C. perfringens α (альфа) β (бетта) ε (эпсилон) Фосфолип летальны Прототокси аза С й н факто р ι (йота) протото ксин А + – – – В + + + – С + + – – D + – E + – – +

Минорные экзотоксины • γ – Т 1 (гамма) – летальный фактор, • δ – Т 2 (дельта) – летальный фактор и гемолитические свойства, • η – Т 3 (эта) – летальный фактор, • θ – Т 4 (тэта) – гемолизин, • κ – Т 5 (каппа) – коллагеназа, летальный, некротический фактор, действие усиливается в присутствии цистеина, • λ – Т 6 (лямбда) – желатиназа, протеиназа, подавляется цистеином, • μ - Т 7 (мю) – гиалуронидаза, • ν – Т 8 (ню) – дезоксирибонуклеаза (разрушает ДНК)

Диагностика клостридий • Экспресс-диагностика через 2 ч: • 1. световая микроскопия: • мазки красят по Граму и определяют подвижность (в препарате висячая капля). • Обнаружение большого количества Гр(+) крупных бактерий с обрубленными концами с субтерминальными спорами в совокупности с другими клиническими симптомами дает основание предполагать, что инфекция вызвана бактериями клостридиальной этиологии. • 2. ИФА на токсины с сыворотками

Чувствительность клостридий к АМП • • Левомицетин Метронидазол Клиндамицин Обязательно проверить на чувствительность к АМП – культивирование проводят в микроанаэростате (37 о. С, 4 часа при 1 атм).

Вопрос 8. Вид C. botulinum • Ботулизм – тяжелая токсикоинфекция, характеризующаяся специфическими параличами • 1896 г. • botulus (лат. ) - колбаса

Клетка C. botulinum (позитивное окрашивание, ТЭМ). Жгутики

Морфологические свойства C. botulinum • • клетки Гр+ с закругленными концами, длина 4 -9 мкм, образуют субтерминальные и терминальные споры – теннисная ракетка Жгутики !!!!

АГ свойства C. botulinum • 8 серотипов (деление основано на различии свойств токсинов): • A – наибольшее значение в США • B – наибольшее значение во Франции • C 1 • C 2 • D • E – наибольшее значение в Японии • F – нет в России • G

Среда обитания C. botulinum • Постоянно споры в воде и почве → фрукты, овощи → кишечник человека и животных → с испражнениями в окружающую среду → состояние споры • Нормальная микрофлора ЖКТ животных и рыб • Споры обнаруживают в 9% проб почвы • и 4% проб воды

Культуральные свойства C. botulinum - строгие анаэробы • Оптимальная температура роста: • Для серотипов A, B, C, D - 34 -35ºC • Для серотипов E, F - 26 -30ºC • Токсины частично разрушаются при +80 ºC

Устойчивость спор C. botulinum • Споры серотипов А, В, F- наиболее устойчивы, разрушаются при кипячении 5 -6 час • Хорошо переносят температуру – 16 о. С в течение года, могут прорасти и образовать токсины. • Продукты, обсеменение большим числом спор, после размораживания могут оказаться токсичными.

Биохимические свойства клеток C. botulinum • 1. Ферментация сахаров – непостоянный признак • 2. В диагностике исследуют протеолитические свойства: • Серотип А, часть В и F – обладает сильным протеолитическим действием, остальные ±. • Серотип А – разлагает казеин, Е – не разлагает, остальные ±. • Используют специальные среды, содержащие печень и фарш. •

Вопрос 9. Основной патогенетический фактор – экзотоксин (ботулотоксин – нейротоксин) • • • Протоксин гидролизуется эндопротеазами. Токсин состоит из 2 -х частей: L - легкой - Zn 2+-зависимая протеаза (50 к. Да) и Н - тяжелой цепи (100 к. Да). связаны S-S мостиками. Н-цепь – якорная, прикрепляется к рецептору клетки. Lцепь – осуществляет специфическое блокирование холинэргической передачи возбуждения в синапсах, разрушая везикулы, содержащие ацетилхолин, при этом нарушается передача нервного импульса.

Механизм действия ботулинического токсина (по D. Kedlaya) Слева-выделение ацетилхолина из нервного окончания в синаптическую щель при помощи комплекса белков (SNAP-25, синтаксин, синаптобревин). Справа - проникновение ботулинического токсина в нервное окончание путем эндоцитоза с образованием токсинсодержащих везикул. В везикулах дисульфидный мостик токсина разрывается, легкая цепь выходит в цитоплазму и расщепляет транспортный белок пресинаптической мембраны SNAP-25, блокируя высвобождение ацетилхолина в синаптическую щель.

Ботулотоксин действует на: • 1. двигательные нейроны спинальных моторных центров и продолговатого мозга, вызывая паралич. • 2. периферические двигательные нервномышечные рецепторы, нарушая передачу возбуждения с нерва на мышцу.

Клинические проявления ботулизма • • Клинические проявления различны: 1. диспепсия 2. нарушение зрения 3. нарушение дыхания • • при характерных признаках ставят разные диагнозы. инкуб. период от 12 - 24 час до 10 сут. летальность 1 -60%, РФ – 9%. чем короче инкуб. период – тем тяжелее заболевание.

Вопрос 10. Вид C. tetani • Возбудитель раневой анаэробной инфекции - столбняка. • Заболевание характеризуется острым течением, параличом ЦНС – судорогами. В ране токсин. • Столбняк – «дремлющая» инфекция – очень большой инкуб. период. • От травмы до заболевания может пройти от нескольких дней до нескольких месяцев.

Характерная поза больного столбняком (опистотонус)

Места обитания C. tetani • в норме в испражнениях человека и животных → на предметы быта, в раны. • С испражнениями попадает в почву, где образует споры, попадая из почвы в организм, вызывает заболевания. • Характерная черта C. tetani – локализация в области поврежденной ткани (ранение, ожог, травма). • Остальные виды клостридий быстро распространяются по другим тканям.

Заболевания, вызываемые C. tetani • десен, зубов, среднего уха, возможна контаминация через иглы. • пупочная культя • заболевание новорожденных: • летальность 40% • летальность обусловлена токсинемией, болеют 2% новорожденных.

Морфология клеток C. tetani • Молодая культура состоит из длинных одиночных, подвижных Гр+ палочек, • в старой культуре Гр-. • Образуют круглые терминальные споры – барабанные палочки.

Морфология клеток C. tetani "Барабанные палочки"

Морфология клеток C. tetani

АГ структура C. tetani • O- АГ и Н- АГ, • по Н-АГ выделяют 10 серотипов. Экзотоксин идентичен для всех серотипов.

Культуральные свойства C. tetani • • облигатный строгий анаэроб, опт. То 35 -37 о. С. среда выращивания общая для всего рода. запах жженного рога + газ. в ЖПС – помутнение через 48 -72 час, растет медленнее, чем C. perfringens. в среде на 2 -7 сутки - токсин, потом он разрушается.

Рост C. tetani на ППС колонии ø 6 мм, прозрачные серо-желтые, через 4 -6 сут. S и R формы. в высоких столбиках – вид чечевицы. гемолиз на кровяном агаре, • не растут в присутствие 20% желчи и • 6, 5% Na. Cl. • споры гибнут при 100 о. С за 1 час. • •

Биохимические свойства C. tetani • ферментативные (сахаролитические) свойства – не выражены. • образуют протеазы и РНК-азы, разжижают желатин •

C. tetani выделяют экзотоксин • → в ЦНС по лимфо- и кровеносным сосудам • → приводит к гиперрефлексии и спазму скелетных мышц - опистотонус • → столбняк

Токсины C. tetani • тетанолизин – разрушает эритроциты, обладает летальным действием – это кардиотоксин. • тетаноспазмин – причина спазмов. Смерть наступает при полном сознании от асфиксии и поражения жизненно важных центров. Сначала наблюдается тоническое сокращение жевательных и мимических мышц, потом затылка и спины.

Лабораторная диагностика • Материал для исследований: гной, кровь, секционный материал. • Микроскопия, но даже нахождение Гр+ палочек не дает основания для постановки диагноза, без определения токсина. • Обязательно! Определение токсина в клиническом материале и культуре. • Диагноз только после проверки сыворотки на мышах.

Профилактика и лечение • профилактика при ранении: • вводят Ig, если не привита вакцина АКДС или вводят анатоксин • донорский противостолбнячный Ig вводят 1 раз