Внутриклеточная логистика: транспортные сети для молекулярных

Внутриклеточная логистика: транспортные сети для молекулярных моторов. Бураков А. В. НИИ ФХБ МГУ 10. 09. 2015.

Сравнительные размеры биологических объектов

Схематическое строение животной клетки

Гибкая мембрана и динамичный цитоскелет позволяют клеткам животных двигаться и вести хищный образ жизни

Основные элементы цитоскелета Микротрубочки Промежуточные Актин филаменты Основные выполняемые функции: поддержание формы и поляризация внутриклеточный транспорт, подвижность, деление клеток.

Внутриклеточный транспорт осуществляется по элементам цитоскелета при помощи моторных белков

Тубулиновый и актиновый цитоскелет Микротрубочки Стресс-фибриллы + Структуры клеточного кортекса + Цитоплазматическая сеть микрофиламентов

две транспортные системы клетки Система Сеть актиновых микрофиламентов, микротрубочек, миозины кинезины и динеин беспорядочное расположение геометрически правильное строение двунаправленный транспорт

Радиальная система микротрубочек – основная транспортная система

Структура микротрубочек полый цилиндр (25 нм) димеры α- и β- тубулина 13 протофиламентов

Замечательное свойство микротрубочек – их динамическая нестабильность. Динамичные концы микротрубочек непрерывно исследуют пространство цитоплазмы

Центросома - «клеточный администратор»

Работа ЦОМТ: образование новых микротрубочек (нуклеация) и удержание старых (заякоривание) Нуклеация МТ: Заякоривание МТ: γ-Tubulin Ring Complex (γ-Tu. RC) Pericentin Ninein PCM-1 Cep 135 BBS 4 EB-1 AKAP 450 CAP 350 CLASP etc.

В качестве «поездов» выступают специальные молекулы – моторные белки, использующие энергию АТФ Кинезин-1 Динеин

Везикулярный транспорт

Лауреаты Нобелевской премии по физиологии и медицине 2013 года (слева направо: Томас Зюдхоф, Рэнди Шекман, Джеймс Ротман).

Очевидные преимущества тубулиновой транспортной системы: 1. Упорядоченное строение обеспечивает максимальную эффективность транспорта 2. Двунаправленность транспорта Радиальная симметрия системы микротрубочек поддерживается благодаря соблюдению двух условий: а. Центросома должна быть расположена в геометрическом центре клетки б. Центросома должна быть функционально активным ЦОМТ

ПОЧЕМУ ЦЕНТРОСОМА РАСПОЛОЖЕНА В ЦЕНТРЕ КЛЕТКИ?

Новый метод локального разрушения МТ позволил исследовать баланс сил, приложенных к центросоме

При локальном разрушении микротрубочек центросома смещается к области разборки …что говорит о присутствии сил(ы), приложенной к центросоме со стороны отходящих от неё микротрубочек. Что же, помимо динамичных плюс-концов МТ, может быть источником таких сил?

Динамика актина

Подавление актомиозиновой сократимости меняет направление смещения центросомы при локальной разборке микротрубочек Выходит, на центросому со стороны микротрубочек действует ещё и некая тянущая сила

Ингибирование динеина приводит к смещению центросомы на край клетки

Локальная разборка микротрубочек после ингибирования одновременно Rho. A и Cdc 42 приводит к хаотичному перемещению центросомы

Итак, в интерфазных клетках животных существует сложный саморегулирующийся процесс поддержания центра симметрии тубулиновой транспортной системы. Позиционирование центросомы осуществляется благодаря совместной работе цитоплазматического динеина, актомиозиновой системы и сил, продуцируемых динамичными плюс-концами микротрубочек.

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ОБРАЗОВАНИЯ РАДИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК

На центросоме присутствует более 300 различных белков, выполняющих самые разные функции С точки зрения внутриклеточного транспорта нас интересуют белки, обеспечивающие радиальность системы микротрубочек, т. е. осуществляющие процессы нуклеации и заякоривания

Ингибирование киназы LOSK нарушает радиальность микротрубочек…

…не затрагивая процессы нуклеации…

… но снижая количество динактина на центросоме

Роль динеин/динактина на центросоме: доставка необходимых компонентов …или что-то ещё?

Ингибирование динеина приводит к хаотизации системы микротрубочек

…так же, как и LOSK, не влияя на нуклеацию на центросоме in vivo …и in vitro

Другой экспериментальный подход – микроинъекции ингибиторов – позволил наблюдать краткосрочные последствия ингибирования динеина

Этот метод также не влияет на процесс нуклеации и на содержание в центросоме перицентрина и найнеина

Итак, цитоплазматический динеин и киназа LOSK участвуют в заякоривании минус-концов микротрубочек на центросоме и организуют их в радиальную звезду, не влияя при этом на процесс нуклеации. Таким образом, динеин и LOSK входят в число белков, необходимых для функционирования центросомы как центра организации тубулиновой транспортной сети.

Актиновые микрофиламенты

Фокальные Стресс-фибриллы контакты Ламеллиподия Филоподии Сократимое кольцо

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ МИОЗИН-ЗАВИСИМОГО ТРАНСПОРТА МЕМБРАННЫХ ОРГАНЕЛЛ ПО АКТИНОВЫМ МИКРОФИЛАМЕНТАМ

Динамика полимеризации актина Стадии полимеризации: 1. нуклеация 2. рост (удлинение филамента) 3. равновесие (тредмилинг) При критической концентрации мономеров (Сс) скорость роста равна скорости разборки филамента

Тредмилинг (treadmilling) актиновых микрофиламентов: рост с одной стороны и укорочение с противоположной

В отличие от микротрубочек, по микрофиламентам груз перемещается лишь в одну сторону и на короткое расстояние – зато их сеть занимает всё пространство цитоплазмы

• Меланофоры рыб и земноводных – модельный объект, в котором работа моторных белков подробно изучена благодаря процессам агрегации и дисперсии пигментных гранул + видео

Стабилизация микрофиламентов подавляет дисперсию меланосом, не влияя на их агрегацию

Джасплакинолид ингибирует миозин-V-зависимый транспорт пигментных гранул

Джасплакинолид не влияет на моторную активность миозина V

Джасплакинолид не меняет распределение микрофиламентов, но замораживает их динамику

Выходит, тредмиллинг актиновых филаментов необходим для миозин-зависимого транспорта

Таким образом, транспорт по актину возможен лишь в одну сторону