Скачать презентацию ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Температура при которой Скачать презентацию ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Температура при которой

Л 7.pptx

  • Количество слайдов: 30

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурны м оптимумом.

При увеличении температуры среды выше температурного оптимума активность ферментов уменьшается. Причина – температурная денатурация При увеличении температуры среды выше температурного оптимума активность ферментов уменьшается. Причина – температурная денатурация белка.

Температурный оптимум ферментов: животного происхождения - 40 -50 о. С; растительного происхождения - 5060 Температурный оптимум ферментов: животного происхождения - 40 -50 о. С; растительного происхождения - 5060 о. С. Topt папаина = ~80 о. С Topt каталазы = ~5 о. С

ВЛИЯНИЕ р. Н СРЕДЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Значение р. Н, при котором скорость реакции ВЛИЯНИЕ р. Н СРЕДЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Значение р. Н, при котором скорость реакции максимальна, называется оптимумом р. Н.

Оптимум р. Н различных гидролаз Фермент Оптимум р. Н Пепсин 1, 5 -2, 5 Оптимум р. Н различных гидролаз Фермент Оптимум р. Н Пепсин 1, 5 -2, 5 Липаза 4, 7 -5, 0 Уреаза 7, 0 Трипсин 7, 8 Аргиназа 9, 5 -9, 9

Чувствительность ферментов к изменению р. Н обусловлено: ü наличием ионогенных групп в активном центре Чувствительность ферментов к изменению р. Н обусловлено: ü наличием ионогенных групп в активном центре фермента; ü наличием ионогенных групп в молекуле субстрата; ü влиянием р. Н на конформацию ферментв, связь апо- и кофермента, ионное состояние аллостерических регуляторов и ионогенных групп аллостерического центра.

ОРГАНИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В КЛЕТКАХ И ТКАНЯХ ОРГАНИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В КЛЕТКАХ И ТКАНЯХ

Органы и ткани многоклеточных организмов отличаются друг от друга по характеру протекающих в них Органы и ткани многоклеточных организмов отличаются друг от друга по характеру протекающих в них метаболических процессов ü качественным и количественным составом ферментов, ü уровнем активности ферментов.

ü Фермент: креатинкиназа. Содержится в мышечной ткани. В сыворотке крови в норме содержится в ü Фермент: креатинкиназа. Содержится в мышечной ткани. В сыворотке крови в норме содержится в следовых количествах. При повреждении скелетной мускулатуры (мышечная дистрофия) и миокарда (коронарная недостаточность), активность креатинкиназы в крови возрастает в 50 и более раз. ü Фермент: гистидаза. Содержится в печени. Обнаружение активности гистидазы в крови – признак патологии печени (гепатит).

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ü ферменты гликолиза, глюконеогенеза, синтеза жирных кислот и холестерина – в ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ü ферменты гликолиза, глюконеогенеза, синтеза жирных кислот и холестерина – в цитозоле, ü ферменты цикла Кребса и β-окисления жирных кислот – в матриксе митохондрий, ü ферменты окислительного фосфорилирования – во внутренней мембране митохондрий, ü ферменты репликации и транскрипции – в ядре.

Ферменты-маркеры внутриклеточных структур. ü маркеры плазматических мембран - Na+, K+АТФаза и аденилатциклаза; ü маркер Ферменты-маркеры внутриклеточных структур. ü маркеры плазматических мембран - Na+, K+АТФаза и аденилатциклаза; ü маркер цитозоля – лактатдегидрогеназа; ü маркер аппарата Гольджи – галактозилтрансфераза; ü маркер лизосом – кислая фосфатаза; ü маркер пероксисом – каталаза и оксидаза Dаминокислот; ü маркер эндоплазматического ретикулума – глюкозо-6 -фосфатаза и НАДФН-цитохром с – редуктаза; ü маркер митохондрий – глутаматдегидрогеназа.

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ И ПРИНЦИПЫ ИХ ОРГАНИЗАЦИИ Ферментная система (мультимолекулярный ферментный комплекс) – совокупность ферментов, ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ И ПРИНЦИПЫ ИХ ОРГАНИЗАЦИИ Ферментная система (мультимолекулярный ферментный комплекс) – совокупность ферментов, катализирующих последовательные стадии превращения определенного субстрата: ü пируватдегидрогеназная и αкетоглутаратдегидро-геназная системы окислительного декарбоксилирования пирувата и α-кетоглутарата животных, ü синтетаза жирных кислот, ü дыхательная цепь митохондрий и хлоропластов.

Особенности ферментных систем: ü пространственная и функциональная ассоциация ферментов в комплексе; ü обеспечение ферментной Особенности ферментных систем: ü пространственная и функциональная ассоциация ферментов в комплексе; ü обеспечение ферментной системой определенной последовательности катализируемых реакций (в пространстве и во времени); ü высокая молекулярная масса комплекса (2· 106 - 10· 106 Да).

Типы мультиферментных систем: ü Растворимые мультиферментные системы (цитоплазматические). Небольшие молекулы субстратов, обладающие высокой скоростью Типы мультиферментных систем: ü Растворимые мультиферментные системы (цитоплазматические). Небольшие молекулы субстратов, обладающие высокой скоростью диффузии, легко переходят от одного фермента к другому. Ферменты метаболических путей.

ü Ассоциированные ферменты, функционирующие совместно. Синтетаза жирных кислот – 7 ферментов, молекулы которых объединены ü Ассоциированные ферменты, функционирующие совместно. Синтетаза жирных кислот – 7 ферментов, молекулы которых объединены в тесно ассоциированный недиссоциирующий комплекс. ü Ферментные системы, связанные с крупными надмолекулярными структурами (например, мембранами). Дыхательная цепь митохондрий.

Регуляция функционирования ферментных систем. Ферментные системы поддерживают суммарную скорость превращения первого (исходного) субстрата. Скорость Регуляция функционирования ферментных систем. Ферментные системы поддерживают суммарную скорость превращения первого (исходного) субстрата. Скорость определяется концентрацией конечного продукта – ингибирование по типу обратной связи, или ретроингибирование.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ

1 этап: подбор количественного теста для определения активности фермента. 2 этап: выбор источника фермента. 1 этап: подбор количественного теста для определения активности фермента. 2 этап: выбор источника фермента. 3 этап: перевод фермента в раствор. • разрушение клеточных мембран (гомогенизация; ультразвук, детергенты, замораживаниеотттаивание и др. ) • экстракция буферными растворами (фосфатный (р. Н 4, 5 -9, 2), ацетатный (р. Н 3, 6 -5, 8), цитратный (р. Н 1, 1 -4, 1), цитратно-фосфатный (р. Н 2, 2 -8, 0), трис (7, 2 -9, 8)).

4 этап: очистка полученного раствора фермента от примесей (диализ, методы фракционирования). Методы фракционирования: • 4 этап: очистка полученного раствора фермента от примесей (диализ, методы фракционирования). Методы фракционирования: • изменение р. Н. • нагревание (при работе с термостабильными ферментами). • использование органических растворителей (ацетон). • использование нейтральных солей (высаливание).

5 этап: получение высокоочищенных ферментных препаратов. Хроматографические методы: • 1. Адсорбционная хроматография. • 2. 5 этап: получение высокоочищенных ферментных препаратов. Хроматографические методы: • 1. Адсорбционная хроматография. • 2. Распределительная хроматография. • 3. Ионообменная хроматография. • 4. Аффинная хроматография (хроматография по сродству). • 5. Гель-хроматография (метод молекулярных сит).

Электрофоретические методы, основанные на движении заряженных молекул белков в электрическом поле со скоростью, зависящей Электрофоретические методы, основанные на движении заряженных молекул белков в электрическом поле со скоростью, зависящей от величины их зарядов при данном р. Н и ионной силе раствора. разделяем ые образцы маркеры молекулярных масс

6 этап: хранение очищенных ферментных препаратов. • высушивание (лиофилизация) • замораживание 6 этап: хранение очищенных ферментных препаратов. • высушивание (лиофилизация) • замораживание

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ГОМОГЕННОСТИ ПОЛУЧЕННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА • ультрацентрифугирование в градиенте плотности ; • электрофорез; МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ГОМОГЕННОСТИ ПОЛУЧЕННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА • ультрацентрифугирование в градиенте плотности ; • электрофорез; • изоэлектрическое фокусирование (разделение в градиенте напряжения и градиенте р. Н); • иммунохимические методы (реакция преципитации фермента с соответствующими ему антителами); • определение растворимости белка (растворимость чистого вещества зависит только от температуры, но не зависит от

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ 1 КАТАЛ (кат) – количество фермента, способное в течение 1 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ 1 КАТАЛ (кат) – количество фермента, способное в течение 1 с обеспечить превращение 1 моля субстрата в стандартных условиях. Единица активности фермента (U, или МЕ) – количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин. 1 кат = 6 · 107 МЕ 1 МЕ = 16, 7 нкат

ü Удельная активность – число единиц ферментативной активности, приходящееся на 1 мг белка (1 ü Удельная активность – число единиц ферментативной активности, приходящееся на 1 мг белка (1 мкмоль/мг белка · мин). ü Молекулярная активность – число молей субстрата, которые подвергаются превращению молекулой фермента за 1 мин. ü Активность каталитического центра – число молекул субстрата, которые претерпевают превращение за 1 мин в расчете на 1 каталитический центр. ü Число оборотов фермента – число молекул субстрата, претерпевающих превращение за 1 мин в расчете на 1 молекулу фермента.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ 1. Химические методы отбор проб из реакционной смеси через определенные МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ 1. Химические методы отбор проб из реакционной смеси через определенные промежутки времени и определение количества продукта (субстрата) реакции определенными химическими методами. Активность фосфатаз, фосфорилаз, нуклеотидаз – по количеству образующегося Фн. Активность гликозидаз – по количеству образующихся восстанавливающих сахаров.

2. Поляриметрические методы за ходом реакции следят по изменению величины оптического вращения (накопление оптически 2. Поляриметрические методы за ходом реакции следят по изменению величины оптического вращения (накопление оптически активного продукта или убыль субстрата). Фермент сахараза; субстрат – сахароза α, D 20 ºС = + 66, 5º; продукты – глюкоза α, D 20 ºС = + 52, 5º; фруктоза α, D 20 ºС = - 92, 4º

3. Хроматографические методы отбор проб из реакционной смеси через определенные промежутки времени и определение 3. Хроматографические методы отбор проб из реакционной смеси через определенные промежутки времени и определение содержания веществ с использованием хроматографических методов (разделение, очистка/выделение), т. е. химическое определение наличия продукта (субстрата) реакции. Активность аминотрансфераз, изоферментов цитохрома Р 450 и др.

4. Манометрические методы за ходом реакции наблюдают по изменению давления при образовании или убыли 4. Манометрические методы за ходом реакции наблюдают по изменению давления при образовании или убыли газообразных веществ. глутаматдегидрогеназа Глутамат γ-аминомасляная кислота + СО 2↑ каталаза 2 Н 2 О 2 2 Н 2 О + О 2↑

5. Спектрофотометрические методы за ходом реакции наблюдают по изменению оптической плотности при λ максимума 5. Спектрофотометрические методы за ходом реакции наблюдают по изменению оптической плотности при λ максимума поглощения продукта, субстрата или кофактора (см. определение активности алкоголльдегидрогеназы – практикум). 6. Флуоресцентные методы за ходом реакции наблюдают по изменению флуоресценции. Флавинзависимые ферменты: ФАД и ФМН флуоресцируют в окисленной форме, в восстановленной – нет. 7. Радиометрические методы метод основан на конкуренции между продуктом реакции и его аналогом, меченым изотопом, за центры связывания на молекуле антитела.