Вирусы бактерий (бактериофаги). Применение в микробиологии и медицине Лекция П. Н. Дерябин
План 1. История вопроса. Определение 2. Морфология, ультраструктура фагов 3. Химический состав 4. Вирулентные, умеренные фаги 5. Стадии взаимодействия фага с клеткой 6. Лизогения и ее значение 7. Профаг, дефектный фаг 8. Распространение в природе 9. Получение, титрование 10. Применение
История и определение • Бактериофа ги (фаги) (от др. -греч. φᾰγω — «пожираю» ) — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки • Н. Ф. Гамалея – 1998 г. – лизис (растворение) колоний сибиреязвенных палочек • Английский бактериолог Туорт, Фредерик – 1915 г. - «остекленение колоний стафилококка» (отнес за счет действия ферментов) • Канадский врач Д’Эрель – 1917 г. – дал объяснение бактериофагии (ультрамикроб, живой паразит бактерий, уничтожающий их. Он писал: «Я потому называю его живым существом, что ассимиляция пищи и способность размножаться принадлежит к числу важнейших признаков жизни» . Успешно использовал фаги для лечения дизентерии, тифа кур (без лечения погибали 95%, при лечении – 5%), чумы •
Строение бактериофага • 1 — головка, 2 — хвост, 3 — нуклеиновая кислота, 4 — капсид, 5 — «воротничок» , 6 — белковый чехол хвоста, 7 — фибрилла хвоста, 8 — шипы, 9 — базальная пластинка • ДНК – 140 генов, которые кодируют 300 белков • Чехол состоит из 114 субъединиц белка, уложенных в 24 завитка • «Волосатый фаг» – имеет многочисленные волоски на оболочке головки
Морфология фагов Различают 6 типов морфологии фага 1. Нитевидные фаги, без видимой головки (лизируют «мужские» особи бактерий; 2. Фаг с аналогом отростка 3. Фаг без отростка 4. Фаг с несокращающимся чехлом у отростка 5. Фаг с коротким отростком 6. Фаг с сокращающимся чехлом у отростка
Классификация фагов • В настоящее время согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов бактериофаги, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты разделяют на ДНК- и РНК- содержащие. • По морфологическим характеристикам ДНКсодержащие фаги разделены на 11 семейств: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Plasmaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Tectiviridae, Microviridae, Inoviridae Plectovirus и Inoviridae Inovirus. • РНК-содержащие – 2 семейства: Cystoviridae, Leviviridae.
Химический состав фагов • Белок – 50 – 60% • ДНК – 40 – 50% • Имеются также и РНК-содержащие фаги, они «они лизируют только «мужские» клетки бактерий, имеющие Sex pili • Углеводы и липиды – небольшие количества • На конце стрежня обнаружены Лизоцим и гиалуронидаза
Условия взаимодействия фага с бактериальной клеткой 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Клетка должна быть живой, молодой. Мертвые клетки только адсорбируют фаг, но внутри мертвой клетки он не размножается. Оптимальное количество клеток – 250 млн/мл; максимальное – 500 млн/мл. При более высокой концентрации бактерий полного лизиса не произойдет. р. Н – слабощелочная (7, 6). Оптимальная температура – температура роста соответствующих бактерий. Питательная среда должна обеспечивать максимальное размножение бактерий, за счет которых будет размножаться фаг. Фаг должен быть специфичен, а клетка чувствительна к фагу Наличие ионов Са, Zn.
Репродукция бактериофага Процесс взаимодействия бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: 1. адсорбция бактериофага на клетке, 2. проникновение в клетку, 3. биосинтеза (репродукция) компонентов фага 4. сборка (созревание) фага, 5. выход бактериофагов из клетки
Адсорбция 1. Бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Адсорбция фага происходит только в том случае, если бактерия к нему чувствительна (фаг специфичен). 2. Различают адсорбцию: • обратимую (фаг не теряет активности и может оторваться от клетки) • необратимую (фаг прочно связан с клеткой)
Проникновение в клетку • Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. • У нитевидных фагов в клетку проникает весь фаг. Белок остается на ЦПМ
Адсорбция бактериофагов на поверхности бактериальной клетки
Биосинтеза (репродукция) компонентов фага • • Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние и. РНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз.
Сборка (созревание) фага • После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс — созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц • Продолжительность процесса репродукции фага может составлять от нескольких минут до нескольких часов. Затем происходит лизис клетки, и освобождаются новые зрелые бактериофаги. • В качестве альтернативы фаг может инициировать лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с генетической системой клеткихозяина, интегрируясь в хромосому или сохраняясь в виде плазмиды
Жизненный цикл бактериофага • • • Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл. Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Инъекция фаговой НК в клетку хозяина. Совместная репликация фаговой и бактериальной НК. Деление клетки. Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь. – Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь). – Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели: • • • Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200— 1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.
Вирулентный фаг. Лизис По характеру взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. • Выход вирулентного фага из клетки сопровождается ее лизисом. Вирулентные фаги = фаги, вызывающие лизис. • Изменения клетки, зараженной вирулентным фагом: 1. Начальная фаза (эклипс-фаза) – нет изменений; 2. Далее – увеличение, вздутие и т. д. Лизис идет по двум типам: а) «взрыв» - основной тип лизиса, происходит быстро (0, 03 -0, 05 сек. ) б) «таяние» - постепенное просветление, растворение После лизиса – клеточная стенка как пустой мешок; цитоплазма – глыба в форме клетки.
Умеренный (латентный) фаг • Умеренный фаг не лизирует, а лизогенезирует клетку, т. е. • • • бактерия становится носителем фага, оставаясь жизнеспособной. Умеренный фаг вместо репликации обратимо взаимодействует с генетической системой клетки-хозяина, интегрируясь в хромосому или сохраняясь в виде плазмиды. Вирусный геном реплицируется синхронно с ДНК хозяина и делением клетки, а подобное состояние фага называется профагом. Бактерия, содержащая профаг, становится лизогенной, внешне ничем не отличаясь от нелизогенных бактерий. Умеренный фаг может переходить в вирулентный. Процесс перехода может спонтанным и индуцированным (УФО, антибиотики, аскорбиновая, яблочная кислоты) Лизогенная конверсия – изменение свойств бактерий под действием профага (лизогенные дифтерийные палочки продуцируют токсин). Дефектный фаг - фаг, потерявший способность образовывать зрелые частицы
Основные свойства фага 1. Специфичность – способность взаимодействовать с определенным видом микроорганизмов 2. Адаптация – способность при пассировании лизировать близкородственные микробы 3. Литическая или лизогенная активность – растворение бактерий или фагоносительство 4. Резистентность: • • Устойчивы к действию радиации, хранению в лиофильно высушенном виде; Чувствительны к дезинфектантам, кипячению, кислотам
Специфичность фага • Моновалентные фаги – лизируют один вид микроба (дизентерийный, холерный, стафилококковый) • Типоспецифический фаг – лизируют определенный тип бактерий внутри вида (стафилококковый 2 а, брюшнотифозный 24 и т. д. ) • Поливалентный фаг – лизирует несколько видов родственных бактерий (в основе феномен адаптации) (кишечная и дизентерийная палочки)
РНФ – реакция нарастания титра фага Используется для диагностики инфекционных заболеваний и косвенного обнаружения микробоввозбудителей по выявлению фагов и нарастанию его титра в исследуемом материале по сравнению с контролем (индикаторный фаг)
Применение бактериофагов 1. Диагностика инфекционных заболеваний 2. Выявление бактериального загрязнения окружающей среды – вода, почва, смывы с больничного (индикация и фаготипирование выделенного возбудителя) 3. оборудования и пр. (эпидемиологические исследования для поиска источника инфекции, путей передачи) Лечение инфекционных больных (жидкие фаги, таблетированные формы): брюшным тифом, дизентерией, стафило-стрептококковыми инфекциями и т. д. 4. 5. Профилактика инфекционных заболеваний Использование в качестве модели для решения теоретических и практических вопросов вирусологии, генетики и т. д.
Вопросы
Скачать презентацию Вирусы бактерий бактериофаги Применение в микробиологии и медицине
5. Вирусы бактерий (бактериофаги).ppt