Вирусология Тема: Строение вирусов
Общая вирусология изучает природу вирусов, строение, размножение, биохимию, генетику.
Формы существования вирусов Вирион ¡ ¡ Вирус
Отличительные признаки вирусов: • содержат один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); • не имеют собственных белоксинтезирующих и энергетических систем; • не имеют клеточной организации; • обладают дизъюнктивным (разобщенным) способом репродукции (синтез белков и НК происходит в разных местах и в разное время); • облигатный паразитизм вирусов реализуется на генетическом уровне; • вирусы проходят через бактериальные фильтры. • размеры колеблются от 15– 18 до 300– 400 нм.
Схематичное строение вируса: 1 - сердцевина (ДНК, РНК); 2 - белковая оболочка (капсид); 3 - дополнительная липопротеидная оболочка; 4 - капсомеры (структурные части капсида).
Расположение капсомеров в капсиде вирусов Спиральный тип симметрии (вирус гриппа – а). Кубический тип симметрии (герпеса - б, аденовируса – в) а б в
Вирусные белки 1. Геномные белки – нуклеопротеиды. Отвечают за репликацию вирусных нуклеиновых кислот и процессы репродукции вируса. 2. Белки капсидной оболочки – простые белки, обладающие способностью к самосборке. 3. Белки суперкапсидной оболочки – сложные белки. Выполняют защитную и рецепторную функции. Подразделяются на: а) якорные белки (контакт вириона с клеткой) б) ферменты (разрушают мембраны); в) гемагглютинины (вызывают гемагглютинацию); г) элементы клетки хозяина.
КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ ДЕЗОКСИВИРУСЫ ДНК двух нитчатая ДНК одно нитчатая 1. Кубический тип симметрии: а) Без внешних оболочек: аденовирусы в)С внешними оболочками: герпес вирусы 2. Смешанный тип симметрии: Т четные бактериофаги 3. Без Определенного типа симметрии: оспенные вирусы Кубический тип симметрии: Без внешних оболочек: крысиный вир. Килхама, адено сателлиты РИБОВИРУСЫ РНК двух нитчатая Кубический Тип симметрии: Без внешних оболочек: реовирусы, вирусы раневых опухолей растений РНК одно нитчатая 1. Кубический тип симметрии: Без внешних оболочек: полиомиелита, энтеро вирусы, риновирусы 2. Спиральный тип симметрии: а) Без внешних оболочек: вир табачной мозаики б) С внешними оболочками: гриппа, бешенства, онкогенные РНК содержащие вирусы
Строение ДНК, РНК ДНК может быть: 1) двухцепочечной; 2) одноцепочечной; 3) кольцевой; 4) двухцепочечной, с одной более короткой цепью; 5) двухцепочечной, с непрерывной и фрагментированной цепями. 1) однонитевой; РНК может быть: 2) линейной двухнитевой; 3) линейной фрагментированной; 4) кольцевой; 5) две одинаковые однонитевые РНК. По форме вирионы могут быть: 1) округлыми; 2) палочковидными; 3) в виде правильных многоугольников; 4) нитевидными и др.
Взаимодействие вирусов с клеткой хозяина 1. Продуктивная вирусная инфекция (репродукция вируса в клетках приводит к гибели клеток хозяина). 2. Абортивная вирусная инфекция (репродукции вируса не происходит, клетка восстанавливает нарушенную функцию). 3. Латентная вирусная инфекция интегративная (происходит репродукция вируса, а клетка сохраняет свою функциональную активность). 4. Вирус-индуцированная трансформация (клетка, инфицированная вирусом, приобретает новые, ранее не присущие ей свойства).
Размножение вирусов в клетке хозяина
Задачи диагностики вирусных инфекций 1. Идентификация и определение видовой принадлежности вирусов в исследуемом материале, изучение природы, химического состава, взаимоотношений с клеткой хозяина, механизмов внутриклеточного паразитизма. 2. Разработка новых методов для лечения и профилактики вирусных болезней. 3. Методы быстрой диагностики для расширения возможностей в лечении и профилактике вирусных болезней с использованием противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и вакцин с различным механизмом действия. 4. Разработка количественных методов определения вирусов для мониторинга противовирусной терапии, определения чувствительности вирусов к препаратам. 5. Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций для проведения противоэпидемических мероприятий (карантин, госпитализация, вакцинация и пр). 6. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний (оспы и др) увеличивает значимость и расширяет задачи лабораторной диагностики. 7. Лабораторная диагностика в службе крови и акушерской практике. 8. Разработка критериев оценки санитарно гигиенической и эпидемиологической значимости находок вируса в объектах внешней среды.
Организация работы лабораторий по диагностике вирусных инфекций 1. Вирусологические лаборатории санитарно эпидемиологических станций проводят исследования в зависимости от эпидемической ситуации, координируя свою работу с деятельностью профильных научно исследовательских институтов. 2. Работа лабораторий строится по плану, согласованному с отделом эпидемиологии, который обязан своевременно сообщать лабораториям об очагах и появлении заболеваний вирусными инфекциями, подлежащими обследованию в вирусологических лабораториях, организовать сбор материала для исследований и обеспечить доставку его в лабораторию. 3. Лабораторный надзор за вирусными инфекциями проводится круглогодично. 4. Проводить исследования по единым методикам. Приложение 1 к Приказу Минздрава СССР от 8 июля 1988 г. N 543
Основные направления деятельности вирусологических лабораторий СЭС: ¡ ¡ наблюдение за циркуляцией вирусов среди населения и в окружающей среде и изучение состояния иммунитета населения с целью определения и прогнозирования эпидемической ситуации в отношении различных вирусных инфекций для своевременного проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий; расшифровка этиологии заболеваний, в том числе групповых, подозрительных на вирусную инфекцию; контроль иммунологической эффективности препаратов, применяемых для профилактики вирусных инфекций; проведение организационно методической работы и поддержание постоянной связи с головными лабораториями и научно исследовательскими институтами.
Задачи вирусологической лаборатории 1. Проведение всех видов исследований с целью: расшифровки этиологии вспышек вирусных заболеваний в коллективах; установления этиологии сезонно возникающих вспышек вирусных заболеваний; изучения циркуляции вирусов для прогнозирования эпидемической ситуации; проведения санитарно вирусологических исследований для определения путей и факторов передачи патогенных вирусов в очагах инфекции; выборочного изучения иммунологической эффективности применяемых вакцин. 2. Проведение анализа результатов исследований и их обобщение. 3. Участие в разработке противоэпидемических и профилактических мероприятий, в составлении прогноза заболеваемости вирусными инфекциями. 4. Оказание методической помощи вирусологическим лабораториям больниц.
НОМЕНКЛАТУРА ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ САНИТАРНОЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ СТАНЦИЙ 1. Вирусологические исследования: Выделение и идентификация вирусов из проб материала от больных, контактных, секционного материала и биологических объектов (клещи, комары и т. д. ). Подготовка переносчиков к исследованию осуществляется зоологами и энтомологами ОООИ. 2. Серологические исследования: Определение антител в сыворотке крови людей к вирусам: 3. Санитарно вирусологические исследования выделение вирусов из объектов окружающей среды: исследование воды (вода питьевая, открытых водоемов и сточные воды); 4. Исследование пищевых продуктов, почвы, предметов обихода (производятся по эпидпоказаниям).
Нормативные и методические ссылки ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ 1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52 ФЗ «О санитарно эпидемиологическом благополучии населения» . 2. Положение о государственном санитарно эпидемиологическом нормировании. Утв. постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 № 554. 3. Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней (СП 3. 1. 3. 2. 1379 03). 4. Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно противоэпидемических (профилактических) мероприятий (СП 1. 1. 1058 01). 6. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I IV групп патогенности (СП 1. 2. 036 95). 7. Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности (опасности) (СП 1. 3. 1285 03). 8. Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно профилактических учреждений (СП 2. 1. 7. 728 99). 9. ГОСТ Р 51592 2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» . Санитарно вирусологический контроль водных объектов (МУ 4. 2. 2029 05). 10. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции, утв. 22. 06. 1995 г. 11. Организация контроля за квалификационным уровнем персонала вирусологических лабораторий по вопросам безопасного лабораторного хранения материала, инфицированного или потенциально инфицированного диким полиовирусом (МР № 0100/8607 07 34 от 23. 08 2007 г. ).
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Вирусоcкопический ¡ Вирусологический ¡ Серологический ¡ Биологический ¡
Вирусоскопический метод Световая микроскопия -для обнаружения крупных вирусов. Электронная микроскопия ультраструктуру вириона, определять концентрацию и дифференцировать вирусы. Иммунная электронная микроскопия – взаимодействие АТ свирусами при смешивании вируссодержащего материала со специфической сывороткой. Иммунофлюоресцентный метод (прямой и непрямой) с использованием флюоресцирующих сывороток. Для экспресс диагностики. Цитологические методы –материалы аутопсии, биопсии, мазки после обработки и окрашиваются анализируются под микроскопом.
Вирусологический метод - культивирование вирусов в культурах клеток или куриных эмбрионах с последующей индикацией и идентификацией Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, гибель), куриных эмбрионах и на клетках (в культурах). Метод культуры ткани и клеток – в диагностике, культивировании, выделении и идентификации вирусов, при получении вакцинных препаратов.
Индикация вирусов Под воздействием вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции, разрушения клеток. Факт размножения вирусов в клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам.
Индикацию (наличие) вирусов осуществляют: по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона. по феномену гемагглютинации. Склеивание эритроцитов под действием гемагглютинина вирусов - по цитопатическому действию вируса (ЦПД). Морфологические изменения клеток, вплоть до их гибели. по образованию в клетках включений. по образованию бляшек. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл. по феномену гемадсорбции. Клеточные культу ры, зараженные вирусом, способны адсорбировать на своей поверхности эритроциты. - по «цветной» реакции. При репродукции вирусов в культуре клеток нарушается их нормальный метаболизм и среда сохраняет свой первоначальный цвет.
Метод бляшек по Дульбекко и Фогт (1954 г. ) Разные вирусы образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краёв, срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса. Тельца включений могут располагаться в цитоплазме, в ядрах клеток. Дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразуюших единицах (БОЕ). ¡ Метод бляшек
Индикацию вирусов проводят по цитопатогеному действию (ЦПД) К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса. Клеточные включения
Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности. ¡ Реакция гемадсорбции
Идентификация вирусов определяется характером вирусного заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения. Методы идентификации: качественные; количественные; по морфологии вирусов; с помощью серологических методов. Для идентификации используются: 1. Типоспецифические сыворотки, основанные на иммунологических процессах взаимодействия АГ АТ; 2. Биологические свойства вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность); 3. Особенности взаимодействия вируса с клеткой хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений).
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ Серологические реакции используются для: серотипирования микроорганизмов, токсинов, антигенов; серодиагностики – определения природы антитела в крови больного с помощью известного антигена (диагностикума). 1. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ: 1. Реакция связывания комплемента (РСК); 2. Реакция диффузной преципитации в геле (модификации); 2. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ: 1. Реакция пассивной и обратной пассивной гемагглютинации РПГА, РНГА); 3. РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ: 1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА, типирование вируса, определение титра АТ); 4. Иммунофлюоресцентный метод; 5. Радиоиммунный метод (РИА); 6. Методы ИФА.
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Фаза 1 взаимодействие антигена и антител при участии комплемента. Фаза 2 - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эр барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Результат опыта наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Р я положительная при полной задержке гемолиза, (жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно), отрицательной (полный лизис эр – «лаковая» кровь).
Реакция преципитации ¡ Формирование и осаждение комплекса растворимого АГ с АТ в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.
РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ РНГА выявления титра специфических антител у больного. В качестве носителя используют эритроциты, нагруженные АГ. Эритроциты склеиваются в присутствии специфических АТ к данному антигену и выпадают в осадок. Результат РНГА. Титр антител 1: 100.
РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ – потеря инфекционности вируса в результате взаимодействия вируса со специфическими АТ. Способность АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. РН применяют для диагностики вирусных инфекций, идентификации вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.
Серотипирование - основной метод идентификации выделенного вируса в реакции нейтрализации. Материал из чистой культуры выделенного вируса обрабатывают смесью диагностических моновалентных сывороток к различным серотипам вируса. Определяют тип вируса, затем его принадлежность к определенному серотипу. А – цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в результате размножения вирусов; Б – ЦПЭ отсутствует в результате предварительной нейтрализации вирусов антителами.
Реакции нейтрализации в РТГА 1. Типирование вируса в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток. 2. Определение титра АТ в крови больного по РТГА. При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов в виде диска. Титр 1: 40
ИФА - выявление АГ с помощью соответствующих им АТ, конъюгированных с ферментом-меткой После соединения АГ с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ и АТ.
РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ) АГ + АТ + электролит = светящийся в УФ - лучах комплекс: микроорганизм + сыворотка, меченная флюорохромом. Краситель изотиоционат флюоресциина (ФИТЦ), люминесцентный микроскоп.
Радиоиммунный анализ (РИА) ¡ Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивает высокую чувствительность в определении вирусного АГ. Определение маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма счетчиков).
Иммуноблоттинг сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков в ИФА. ¡ ¡ ¡ Идентификация АТ к внутренним и наружным вирусным АГ позволяет определять стадию заболевания. При анализе популяций — изменчивость вирусных белков. При ВИЧ инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных АГ и АТ к ним. Анализ антигенов, синтезируемых с помощью рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.
Биологический метод. Выделение вирусов осуществляют с целью: определения циркулирующего варианта вируса; дикого или вакцинного штамма ; для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов. Основан на использовании животных, чувствительных к определенному вирусу
Классические методы выделения и изучения вирусов: ¡ ¡ ¡ ¡ 1. Выделение вируса в культуре клеток (ИФА с моноклональными антителами, ПЦР). 2. Микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала 3. Серологические – продукция АТ к вирусным АГ (четырехкратного возрастания титра антител к вирусу на разных стадиях заболевания). 3. Микрометоды для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики. 4. Экспресс тесты: а. РИА. б. Иммунофлюоресцентный анализ. в. Твердофазный ИФА.
Забор материала для вирусологических исследований ¡ ¡ Образцы отбирать как можно раньше с учетом ритма циркуляции возбудителя; Материал отбирать в объеме, достаточном для всего комплекса исследований; Образцы доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной при t 50°С. Соблюдают правила асептики, пробу помещают в стерильный контейнер и транспортируют в лабораторию.
Материалом для выделения вируса в культуре клеток могут служить - мазки со слизистой глотки и носоглотки, мокрота, моча, кал, кровь, СМЖ, экссудат, биоптат. ¡ – при респираторных инфекциях – носоглоточный смыв; ¡ – при энтеровирусных инфекциях – смыв и фекалии (рео , энтеровирусы); ¡ – при поражениях кожи и слизистых оболочек – соскобы, содержимое пузырьков (герпес, ветряная оспа); ¡ – при экзантемных инфекциях – смывы (корь, краснуха); ¡ – при арбовирусных инфекциях – кровь, спинномозговая жидкость. Среда, в которую берется материал, транспортируется и хранится. Носоглоточные или ректальные мазки, содержимое везикул помещают в среду, содержащую белок, предотвращающий потерю инфекционности вируса (если планируется его изоляция), или в соответствующий буфер (если планируется работа с нуклеиновыми кислотами). ¡
Современные лабораторные методы для диагностики вирусных инфекций 1. Выделение и идентификация возбудителя (культивирование); 2. Микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала; 3. Обнаружение и определение титров противовирусных антител (серологический); 4. Обнаружение антигенов вирусов в образцах исследуемого материала (иммуноблот).
Лабораторная идентификация вирусов 1. Обнаружение вирусспецифических АГ в инфицированных клеточных культурах с помощью моноклональных антител к ранним белкам возбудителя в РИФ, ИФА, ПЦР ответ через 24– 72 ч. 2. Серологическая диагностика (реакции АГ – АТ). Продукцию антител к вирусным антигенам оценивают с помощью РН, (РНТГА), РСК, ИФА, РИФ, РИА. 3. Микрометоды для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и серодиагностики с целью определения нарастания антител. 4. Экспресс диагностика основана на применении стандартных противовирусных антител в РИА, РИФ, твердофазном ИФА.
Прямые методы (РИФ, ИФА) Позволяют обнаружить вирус, вирусный АГ или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, являются наиболее быстрыми (2– 24 ч). Имеют ограничения (возможность получения ложноположительных, отрицательных результатов), недостаточно специфичны. Поэтому они требуют подтверждения непрямыми методами (серологическими).
Молекулярная биология Изучает первичную молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку, особенности репродукции вирусов, определения последовательности вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка.
Методы молекулярной биологии 1. 2. 3. Метод гибридизации ДНК, (метод ДНК зондов). Выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Моноклональные антитела.
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот ¡ ¡ Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки. ДНК или РНК зонды, меченные изотопом (32 Р) или биотином, обнаруживающие комплементарные нити ДНК или РНК. точечная гибридизация – блот гибридизация – гибридизация in situ
Гибридизация нуклеиновых кислот ¡ ¡ ¡ Принцип комплементарности азотистых оснований При t 96 100°C происходит денатурация ДНК При t 65°C происходит ренатурация, гибридизация (отжиг).
Использование рестриктаз и лигаз позволяет объединять в пробирке любые фрагменты молекул ДНК Разъединённые цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других односпиральных ДНК, РНК, имеющих комплементарные участки расположения нуклеотидов, образуя комплексы ДНК – РНК или РНК – ДНК.
ДНК – микрочип состоит из множества дезоксиолигонуклеотидов, которые могут являться любым компонентом ДНК, используются для гибридизации с к. ДНК и м. РНК. При помощи флюоресценции или хемолюминесценции регистрируется гибридизация зонда и мишени, определяется количество НК с заданной последовательностью в образце.
Нанотехнология биочипов позволяет в течение нескольких часов идентифицировать: ¡ ¡ ¡ ¡ Туберкулез и его лекарственно устойчивые формы (49 мутаций). Варианты гриппа А, включая птичий грипп H 5 N 1(30 подтипов). ВИЧ, гепатиты В и С, простой герпес, неонатальные инфекции. Особо опасные инфекции (чуму, сибирскую язву, оспу). Хромосомные нарушения при онкозаболеваниях. Генетическую предрасположенность к онкозаболеваниям и индивидуальную переносимость определенных типов лекарств. Генетические маркеры личности. Используется для изучения экспрессии генов и поиска мутаций в биомедицинских исследованиях. ДНК микрочипы могут одновременно измерить экспрессию десятков тысяч генов у человека и выявить около миллиона мутаций.
Полимеразная цепная реакция (1983 г. Кэри Муллис) Основана на принципе естественной репликации ДНК. Заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК полимеразы и двух специфических затравок – праймеров. Копирование заданного участка происходит, если он присутствует в исследуемом образце.
ПЦР Амплификация молекул ДНК in vitro. ¡ Гель, содержащий маркерную ДНК. При проведении ПЦР выполняется 20— 35 циклов.
Виды ПЦР 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Вложенная ПЦР (Nested PCR) Инвертированная ПЦР (Inverse PCR) ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT PCR) Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR) Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q PCR) Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR) Метод молекулярных колоний (Colony - PCR Colony) ПЦР с быстрой амплификацией концов к. ДНК (Rapid amplification of c. DNA ends, RACE-PCR) ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) Групп специфическая ПЦР (group-specific PCR) ПЦР с использованием горячего старта (Hot-start PCR) Виртуальная ПЦР (in silico PCR)
Возможности ПЦР ¡ ¡ Медицинская диагностика возможность ускорить диагностику наследственных заболеваний. Обнаружение инфекции сразу после заражения, до того, как проявятся симптомы заболевания. Определение нуклеотидной последовательности ДНК, РНК. Диагностика латентных вирусных инфекций и ВИЧ инфекции.
Возможности ПЦР - генная инженерия ¡ ¡ ¡ Клонирование генов процесс выделения и получения большого количества продукта данного гена. В промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др. Секвенирование ДНК позволяет определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле. Мутагенез внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК. Моноклональные антитела. Метод гибридизации ДНК, или метод ДНК зондов.
Клонирование гена с использованием плазмиды ¡ (1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.
Моноклональные антитела (Monoclonal antibodies) Гомогенные антитела, продуцируемые иммунными гибридными клетками, произошедшими из одной плазматической клетки – предшественницы (клона). МА сочетают способность синтеза специфических Ig одного изотипа с неограниченной пролиферацией. МА могут быть выработаны против любого природного антигена.
Возможности моноклональных антител ¡ ¡ повысить чувствительность и воспроизводимость диагностических тестов; дифференцировать антигенные варианты вируса внутри одного серотипа; выявление протективных эпитопов в составе рекомбинантных иммуногенов; средство хроматографической очистки и выделения из смеси вирусных антигенов (поверхностного антигена HBV), разнообразных биологически активных веществ (интерферонов).
Скачать презентацию Вирусология Тема Строение вирусов Общая вирусология изучает
Лекция СТРОЕНИЕ ВИРУСОВ.ppt