ВИЧ сегодня. Современные методы диагностики.
Употребляя термин «СПИД» , не все знают, что это не самостоятельное заболевание, а терминальная (последняя) стадия ВИЧ-инфекции – инфекции, вызванной Вирусом Иммунодефицита Человека
Актуальность проблемы • На земном шаре зафиксировано более 40 млн ВИЧ- инфицированных и более 16 млн из них погибло от СПИДа. • В странах Африки до 15 -20% взрослого населения поражено ВИЧ, в США – более 0, 5%, в некоторых странах Европы (Испания, Франция, Швейцария и др. )– 0, 3 -0, 5% населения. • В России уже зарегистрировано более 300 тыс. ВИЧинфицированных, и пандемия продолжается. • За последние 5 лет отмечена арифметическая прогрессия роста заболеваемости и летальности населения города Омска и Омской области.
Цель и задачи Ø • • • Цель: Познакомиться с системой организации выявления, лабораторного контроля и лечения ВИЧ-инфекции у населения города Омска и Омской области по данным «Центра по профилактике и борьбе со СПИД-ом и инфекционными заболеваниями» и за последние 5 лет (10 лет). Задачи: Познакомиться со структурой сети лабораторий, занимающихся диагностической ВИЧ и их оснащением. Познакомиться с современными методами лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Изучить ситуацию заболеваемости ВИЧ-инфекции и летальности населения города Омска и Омской области.
Вирус иммунодефицита человека Подсемейство – Lentivirnae Семейство – Retroviridae • • Имеет 2 формы: ВИЧ-1 и ВИЧ-2 Это РНК -вирус с диплоидным геномом (представлен двумя идентичными молекулами позитивной РНК) Особенности репродукции связаны с функциями фермента обратной транскриптазы, которая обеспечивает обратную направленность потока генетической информации. Репродуктивный цикл ретровирусов уникален, так как при его реализации образуются промежуточные продукты- интермедиаторы ДНК.
Строение ВИЧ
Генетическое строение ВИЧ • • • 9 генов ВИЧ кодируют, по крайней мере, 15 белков. Гены gag, pol, и env несут информацию о структурных белках вируса. pol — кодирует ферменты: обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. gag — кодирует полипротеин, расщепляемый протеазой до p 6, p 7, p 17, p 24. env — кодирует белок gp 160, расщепляемый протеазой на gp 41 и gp 120. Другие шесть генов — tat, rev, nef, vif, vpr, vpu (vpx у ВИЧ 2) — кодируют белки, отвечающие за способность ВИЧ инфицировать клетки и производить новые копии вируса.
Патогенез ВИЧ Ø Основной фактор патогенеза ВИЧ- гиперактивация иммунной системы в ответ на инфекцию. Ø В качестве рецептора ВИЧ использует молекулу CD 4. Ø Мишени для ВИЧ - Т-хелперы, моноциты, макрофаги и родственные клетки Ø Особенность патогенеза – способность избегать действия иммунных механизмов за счет интеграции его генома в ДНК , а также антигенной изменчивости, обусловленной «рабочими ошибками» обратной транскриптазы. Ø Механизмы патогенеза включают апоптоз, образование синцитиев, аутоиммунные реакции, инфицирование клеток предшественников. Ø Помимо иммунотропности, ВИЧ проявляет выраженную нейротропность.
Стадии инфекционного процесса Ø Инкубационный период (период сероконверсии - до появления Ø Продромальный период – стадия первичного инфицирования – Ø Латентный период. Единственное проявление — стойкое Ø Пре. СПИД — продолжительность 1 -2 года — начало угнетения Ø Терминальная стадия - СПИД – 1 -2 года. детектируемых антител к ВИЧ) – от 3 -х недель до 1, 5 месяце до 1 месяца. Клинические проявления: субфебрильная температура, воспаление лимфатических узлов — они становятся увеличенными, мягкими и болезненными(проходит под маской инфекционного мононуклеоза). Максимальная концентрация вируса, антител появляется только в самом конце продромального периода. увеличение лимфатических узлов(плотные, безболезненные) — лимфоаденопатия. клеточного иммунитета. Часто рецидивирующий герпес — долго не заживающие изъязвления слизистой рта, половых органов. Лейкоплакия языка (разрастание сосочкового слоя- «волокнистый язык» ). Кандидоз — слизистой рта, половых органов.
Методы диагностики ВИЧинфекции I. Выявление антител к ВИЧ • • • II. Обнаружение антигенов ВИЧ • III. V. ПЦР диагностика Выделение вируса • IV. ИФА на антиген р24 Обнаружение ДНК вируса • IV. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) Иммунный блоттинг (ИБ) Метод непрямой иммунофлюоресценции Радиоиммунопреципитация Метод агглютинации Метод культуральной диагностики Выявление иммунологических нарушений Экспресс-тесты
Методы лабораторной диагностики, используемые сегодня: v ИФА v Иммунный блоттинг v ПЦР v Экспресс-тесты
Лабораторные исследования Ø Ø Ø Скрининговые (ИФА) Диагностические (ИБ) Прогностические (ПЦР) Данные исследования проводятся в лабораториях: • Скрининговые • Референтные • Экспертные
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) • • • Основной метод выявления антител в ВИЧ По изменению окраски комплекса фермент-субстрат обнаруживается присутствие исследуемого антигена (или антитела), реагирующего с входящими в состав тест-системы, соответственно, специфическим антителом или антигеном. Возможны ложноположительные результаты в 0, 02 - 0, 5% случаев Возможно ложноотрицательные результаты в 3 -5% случаев Число ошибочных результатов можно снизить при использовании в качестве антигена рекомбинантных белков ВИЧ
Точность метода ИФА • • Точность диагностики ВИЧ методом ИФА зависит от периода развития заболевания Антитела к ВИЧ обнаруживаются в крови в достаточном для определении количестве только на 3 -ий месяц после заражения Период, когда вирус в организме уже есть, но антитела еще не обнаружены, называется периодом развития антител, периодом сероконверсии или периодом «серонегативного окна» . В период «окна» тест на ВИЧ будет отрицательным, т. е. по результатам ИФА он будет здоров
Иммунный блоттинг (Western-blot) • • • Основан на взаимодействии специфических антител с электрофоретически раздёлёнными фракциями антигенов. Обычно используется для подтверждения результатов ИФА. Включает в себя стадии: Подготовка стрипа Ø Исследование пробы Ø Трактовка результата Ø
Оценка результатов исследований методом ИБ • Положительный результат — обнаружение в сыворотке антител к двум вирусным белкам из группы env с наличием или отсутствием белков — продуктов других структурных генов (gag, pol). • Отрицательный результат — отсутствие антитела к вирусспецифическим белкам. • Неопределенный результат — обнаружение в сыворотке антител к белкам из групп gag, pol.
ВИЧ Western Blot – тест-система фирмы Organon Teknika для опрделения антител к ВИЧ в сыворотке и плазме крови Полоски-стрипы из блота. Чтение результатов. Полоска А - Положительный контроль Полоска В - Слабоположительный контроль Полоска С - Отрицательный контроль Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1) В положительном контроле и исследуемом образце присутствуют пол gag p 17, p 24, p 55 (оболочка) pol p 31 (эндонуклеаза), p 51, p 65 (обратная транскриптаза) env gp 41 (трансмембранный белок) gp 120, gp 160 (поверхностные структуры)
v Метод непрямой иммунофлуоресценции • v Радиоиммунопреципитация • v В качестве антигенов в этой реакции используются различные клеточные линии, инфицированные ВИЧ (MOLT, H 9, СЕМ, HUT-78 и др. ). В основе метода лежит использование белков ВИЧ, меченных радиоактивным йодом. Метод агглютинации • Является одним из наиболее простых, чувствительных и специфичных для определения антител к ВИЧ.
Выделение вируса • Метод культуральной диагностики v Требует соблюдения особых условий безопасности, дорогостоящих и дефицитных сред, значительных затрат времени, и, кроме того, по данным некоторых исследователей, чувствительность метода колеблется от 25 до 75%.
Обнаружение ДНК вируса ПЦР – полимеразная цепная реакция • • Обладает высокой чувствительностью ПЦР – это обнаружение не антител к ВИЧ, а самого вируса в организме Позволяет обнаружить геном ВИЧ, встроенный в геном пораженных лимфоцитов Возможна при наличии вирусных генов всего 1 из 5000 клеток Позволяет определить наличие или отсутствие ВИЧ в период «окна» при неясном результате ИБ Используется для назначения лечения АРВТ и контроля лечения Для определения ВИЧ-статуса новорожденных, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей Возможна дифференциальная диагностика между ВИЧ-1 и ВИЧ-2
Проведение ПЦР-анализа: подготовка клинической пробы к проведению ПЦР, представляющей выделение суммарной ДНК и очистку ее от ингибиторов ДНК-полимеразы; Ø проведение ПЦР в автоматическом амплификаторе; Ø детектирование ампликонов методом электрофореза или ДНК-гибридизации. Ø
Экспресс-тесты Иммунохроматографический анализ (ИХА) • • • Применяют в экстренных ситуациях (роды, экстренные опреации) Максимально быстрый результат Основаны на выявлении в крови спкецифических антител к ВИЧ Может проводиться самостоятельно без специальной подготовки Результат должен быть подтвержден стандартным тестированием на ВИЧ Обеспечивается максимальная анонимность исследования
Ретрочек-ВИЧ • • Экспресс-тест Представляет собой одноразовый набор, в составе которого: Реакционный картридж с 3 -мя отверстиями: v Нитроцеллюлозная мембрана с последовательно нанесенными 3 -мя позициями: Ø ü ü ü Конъюгат – смесь рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, кроличий Ig. G, конъюгированные с коллоидным золотом Смесь рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 Антикроличий Ig. G (контроль прохождения реакции) Пластиковая пипетка Ø Буферный раствор для диффузии образцов Ø
Статистические данные: По материалам "Центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями" Динамика ежегодной регистрации случаев ВИЧ-инфекции в Российской Федерации за 1987 -2007 годы (кумулятивное количество случаев на 31. 12. 2007 г. - 417715).
Динамика ежегодной регистрации случаев ВИЧинфекции на территории Омской области за 19962007 год За пределами Омской области Общее количество случаев – 733.
Распределение случаев ВИЧ-инфекции в Омской области с учетом предполагаемой территории заражения за 1996 -2007 годы. За пределами Омской области Омская область
Заболеваемость ВИЧ-инфекцией среди населения г. Омска и сельских районов Омской области за 1996 -2007 годы (на 100 тысяч населения). Город Село
Распределение ВИЧ инфицированных, выявленных в Омской области, по установленным путям передачи возбудителя за 1996 -2007 годы Парентеральн ый Половой Вертикальный
Распределение ВИЧ инфицированных, выявленных в Омской области, по половым группам за 1996 -2007 годы. Мужчины Женщины
Выявление ВИЧ-инфекции у беременных женщин и рождение детей ВИЧ- инфицированными женщинами в ЛПУ Омской области.
. Количество случаев смерти ВИЧ инфицированных по Омской области за 1997 -2007 гг.
Структура летальных исходов больных ВИЧ/СПИД в Омской области за период с 1996 -2007 гг. (в %). Заболевания органов дыхания Отравления опиатами Онкология Туберкулез Прочие заболевания Внешние причины Гнойносептические инфекции
Эпидемическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Омской области на 01. 12. 2008 г: v В Омской области на 01. 11. 2008 года зарегистрировано 1383 (! ) случая ВИЧинфекции
Юридические последствия заражения человека ВИЧинфекцией: v За заражение другого человека ВИЧинфекцией или поставление его в опасность заражения ВИЧ-инфекцией в значительном числе государств предусматривается уголовная ответственность v В России соответствующие меры наказания предусматриваются статьей 122 УК РФ
Выводы: Для диагностики ВИЧ необходимо: • Своевременная диагностика • Подбор метода диагностики в зависимости от времени, прошедшего с предполагаемого момента заражения • Комбинация различных методов для более точных результатов Наиболее точный метод на сегодняшний день: • ПЦР
• 1 декабря – Всемирный день борьбы со СПИДом • Третье воскресенье мая – День памяти умерших от СПИДа • 1 раз в 2 года – Международная конференция по СПИДу
Спасибо за внимание!
Скачать презентацию ВИЧ сегодня Современные методы диагностики Употребляя термин
ВИЧ.ppt