Верховский Олег Анатольевич доктор биологических наук профессор Иммунная

Верховский Олег Анатольевич, доктор биологических наук, профессор Иммунная система и методы ее оценки у свиней. Современные методы диагностики и профилактики вирусных болезней п. Краснообск, Новосибирской обл. , 16 мая 2013 г.

Основные темы доклада Основные понятия об иммунной системе и иммунитете. l Оценка иммунного статуса организма свиней. l Современные методы диагностики и профилактики вирусных болезней (на примере цирковирусных болезней свиней – ЦВБС) l Стратегия DIVA (на примере болезни Ауески) l

Иммунодиагностика Специфическая профилактика Иммунная система и ИММУНИТЕТ Основной фактор здоровья животных

ИММУННАЯ СИСТЕМА И ИММУНИТЕТ «Иммунная система- совокупность всех лимфоидных органов и скоплений лимфоидных клеток тела. Лимфоидная система организма представляет собой морфологический синоним иммунной системы. Совокупность лимфоидных органов и тканей составляет единый орган иммунитета» Р. В. Петров, 1982 г. Иммунитет - механизм защиты организма от всех антигенно чужеродных веществ как экзогенной, так и эндогенной природы. Биологический смысл иммунитета - обеспечение структурной и функциональной целостности организма.

ВИДЫ (ТИПЫ) ИММУНИТЕТА - Гуморальный иммунитет - Клеточный (клеточно – опосредованный) иммунитет - Естественный (врожденный) иммунитет: система предсуществующих защитных факторов организма: физические и физиологические барьеры, фагоциты, натуральные клетки-киллеры (NK-клетки) - Приобретенный (специфический) иммунитет - Общий (системный) иммунитет - Местный иммунитет (иммунная система слизистых) - Активный иммунитет (естественно приобретенный – после инфицирования; искусственно приобретенный – после вакцинации) - Пассивный иммунитет (перенос антител от иммунного донора)

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ИММУННОГО ОТВЕТА • Специфичность • Разнообразие • Иммунологическая память • Способность к окончанию иммунного ответа • Способность отличать своё от чужого ФАЗЫ ИММУННОГО ОТВЕТА • Фаза распознавания антигена • Фаза активации (пролиферация и дифференциация лимфоцитов) • Эффекторная фаза (элиминация антигена)

Особенности естественного и приобретенного иммунитета Врожденный иммунитет Приобретенный (специфический) иммунитет Физико-химические барьеры кожа, мембраны клеток слизистых оболочек; желудочный сок; бактерицидные факторы иммунная система кожи и слизистых, антитела в секретах слизистых Основные типы клеток фагоциты (макрофаги, нейтрофилы), NK- клетки Т- и В- лимфоциты Циркулирующие молекулы комплемент антитела Растворимые медиаторы цитокины, секретируемые лимфоцитами: макрофагами: IL-1, IL-6, IL T 1 (IL-2, IFN- , TNF-2), H -12 TH 2 (IL-4, IL-5, IL-10) Основные иммунологические реакции фагоцитоз; альтернативный путь активации комплемента · клеточный (ЦТЛ, TH 1, TH 2) и гуморальный (Ig. M, Ig. G, Ig. A, ) иммунный ответ; антитело-зависимая клеточная цитотоксичность; фагоцитоз с участием антител; классический путь активации комплемента

9 Кинетика иммунного ответа при острой вирусной инфекции Клеточный Гуморальный Ответ Антитела ЦТЛ NK Дни после заражения

Основные иммунологические функции антител Иммунологическая функция Патогены* Основные изотипы антител Вовлеченные неспецифические кофакторы Опсонизация В, Б, Г Ig. G, Ig. M Фагоциты и комплемент (в некоторых случаях) Нейтрализация В Ig. G, Ig. M, Ig. A Комплемент (в некоторых случаях) Ингибирование связывания Б, П (? ) Ig. A Нет Цитолиз В 1, Б, П Ig. G, Ig. M Комплемент Нейтрализация токсинов Б Ig. G Нет Ингибирование ферментов В, Б (? ) Ig. G Нет AЗКЦ В, Г (? ), П (? ) Ig. G, Ig. A Нет Ингибирование роста М, Б Ig. G, Ig. A Нет Лактоферрин

СВЯЗЬ МЕЖДУ ТИПОМ ПЛАЦЕНТЫ И ПЕРЕДАЧЕЙ МАТЕРИНСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Колебания титра антител Средний уровень антител Минимальный титр, блокирующий вирулентный вирус Минимальный титр, блокирующий вакцинный вирус

Факторы, влияющие на иммунитет Факторы, связанные lвирулентность возбудителя с инфекционным lдоза возбудителя и путь агентом проникновения его в организм Факторы, связанные l возрастная резистентность с организмом l генетическая резистентность (первичные иммунодефициты) l рацион l материнский иммунитет Факторы окружающей среды плотность популяции и условия содержания (температура, влажность) l стресс l

Оценка иммунного статуса организма: Имеет прогностический характер как в отношении устойчивости организма к заболеваниям, так и в отношении эффективности используемых вакцин. У животных с низким иммунным статусом или у гиперреактивных особей поствакцинальный иммунный ответ будет не адекватен таковому, характерному для животных (птиц) с нормативными показателями.

Оценка иммунного статуса: иммунологические методы l Общие неспецифические методы, характеризующие состояние различных звеньев иммунной системы: лимфоцитов, гранулоцитов, фагоцитов, комплемента. К ним относятся реакция спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК), методы оценки функциональной активности макрофагов и нейтрофилов, методы определение пролиферативного ответа на основные Т- и В- клеточные митогены и др. Современные методы: основаны на использовании моноклональных антител (Мк. А) к поверхностным антигенам (маркерам) клеток иммунной системы (CDантигенам). С использованием панели Мк. А и методов иммунофлюоресценции (РИФ) и лазерной проточной цитофлюориметрии (FACS) можно количественно охарактеризовать различные субпопуляции лейкоцитов, в т. ч. находящихся на разных стадиях дифференцировки. l Специфические методы, позволяющие выявить антитела, иммунные лимфоциты, антигены в организме животных и человека или антигены возбудителя во внешней среде ( для лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней, определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений)

Методы оценки иммунного статуса: Фагоциты и фагоцитоз Задача исследований 1 -го уровня 2 -го уровня - определение абсолютного числа нейтрофилов и моноцитов; - определение миграционной активности фагоцитов); - оценка функционального состояния фагоцитов - определение экспрессии молекул адгезии (CD 11 a, CD 11 b, CD 11 c, CD 18) на поверхностной мембране нейтрофилов. Методы Количественные - лейкограмма, - FACS Оценки функциональной активности - реакция восстановления нитросинего тетразолия - реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) и направленный хемотаксис

Т- клетки и клеточный иммунитет Задача исследований 1 -го уровня - определение общего числа лимфоцитов; Методы 2 -го уровня - определение продукции цитокинов (интерлейкинов, интерферонов и др. ); - определение процента и абсолютного числа зрелых Тлимфоцитов (CD 3), хелперов - определение (CD 4) и цитотоксических активационных молекул (CD 8); на поверхностной мембране Т- лимфоцитов - определение (CD 25, антигены МНС) и пролиферативного ответа на молекул адгезии (CD 11 a, основные Т- митогены: CD 18); фитогемагглютинин (ФГА) и конкавалин А (Ко. А) - определение пролиферативного ответа на специфические антигены; - кожные тесты с рядом микробных антигенов. Количественные Оценки функциональной активности - лейкограмма, - реакция гиперчувствительн - Е-РОК, ости замедленного типа (РГЗТ), - РИФ, - реакция - FACS бласттрансормации лимфоцитов (РБТЛ), - цитотоксический тест, - реакция отторжения трансплантата

В- клетки и гуморальный иммунитет Задача исследований Методы 1 -го уровня 2 -го уровня Количественные - количественное определение уровня Ig. G, Ig. M, Ig. A и Ig. E в сыворотке крови; - количественное определение субклассов Ig. G и s. Ig. A; - определение соотношения - и цепей; - определение специфических антител к белковым и полисахаридным антигенам; - определение способности лимфоцитов к пролиферативному ответу на В-митогены (липополисахарид, стафилококк) и Т-Вмитогены (митоген лаконоса). - РИД, - ИФА, - РИФ, - FACS - ИФА в точках (ELISPOT), - метод комплементарного розеткообразования - метод гемолитических бляшек - определение процента и абсолютного количества Влимфоцитов (CD 19, CD 20) в периферической крови. Оценки функциональной активности - иммунизация (иммунный ответ in vivo на антигены) -гемолитическая активность комплемента (СН 50)

Реагенты к CD-антигенам и другим поверхностным маркерам клеток иммунной системы SOURCE Short Name URL: l l l l Ab. D Serotec http: //www. abdserotec. com/catalog/ Affymetrix Procarta Panomics Procarta http: //www. panomics. com Antigenix America Antigenix http: //www. antigenix. com/ ATCC American Type Culture Collec. ATCC http: //www. atcc. org/ Aushon Bio. Systems Aushon http: //www. aushon. com/Menu. php BD Bioscience/Pharmingen BD http: //www. bdbiosciences. com/home/ Beckman Coulter Beckman http: //www. beckmancoulter. com/wsrportal/wsr/research-anddiscovery/products-and-services/flowcytometry/antibodies-toanti-porcine-antigens/index htm Bethyl Laboratory Inc. Bethyl http: //www. bethyl. com/ Cell Sciences Cell Science http: //www. cellsciences. com/content/pprodlist. asp? search=global Fitzgerald/Research Diagnostics Fitzgerald http: //www. fitzgerald-fii. com/ Invitrogen/Bio. Source Invitrogen http: //www. invitrogen. com/site/us/en/home/brands/Bio. Source. html? CID =fl-biosource Kingfisher Biotech, Inc Kingfisher http: //www. kingfisherbiotech. com/ Millipore http: //www. millipore. com/catalogue/index. do PBL Interferon Source PBL http: //www. interferonsource. com/ Pierce/Endogen Thermo http: //www. piercenet. com Prospecbio (Israel) Prospec http: //www. prospecbio. com/ R&D Systems R&D http: //www. rndsystems. com/ Southern Biotech S. Biotech http: //www. southernbiotech. com/ Thermo Scientific/Pierce/Endogen Thermo http: // www. thermoscientific. com http: //www. piercenet. com Tridelta Development Ltd (Ireland) Tridelta http: //www. trideltaltd. com/vkinemain. html VMRD, Inc. VMRD http: //www. vmrd. com/products/antibodies/ US Veterinary Immune Reagents Net VIRN www. vetimm. org l l l l DGIL Porcine Immunology and Nutri. PIN db http: //www. ars. usda. gov/Services/docs. htm? docid=6065

Иммуноглобулины (Ig) – основной компонент системы гуморального иммунитета Иммуноглобулины, обладающие определенной специфичностью – антитела Концентрация циркулирующих в крови Ig – основной критерий иммунного статуса организма животных

Количественное определение уровня иммуноглобулинов – наборы для РИД по Манчини (лаб. иммунологии ГНУ ВИЭВ) Ig. G Ig. M

Концентрация Ig. G как маркерный показатель состояния организма содержание Ig. G по группе поросят в целом: 17, 1 ± 4, 8 мг/мл содержание Ig. G у клинически содержание Ig. G у здоровых поросят: больных поросят: 19, 3 ± 1, 6 мг/мл 14, 4 ± 5, 3 мг/мл

Анализ содержания иммуноглобулинов и специфических антител в сыворотках крови поросят в период доращивания № п/п Концентрация иммуноглобулинов, мг/мл Ig. G Ig. M Ig. A 1 21, 2 4, 5 0, 92 2 19, 5 4, 8 0, 85 3 15, 1 3, 4 0, 68 4 18, 1 4, 4 0, 75 5 5, 6 0, 82 0, 22 6 5, 4 1, 8 0, 16 7 5, 0 0, 7 0, 18 8 5, 2 0, 54 0, 12 9 5, 7 0, 84 0, 14 протективный уровень поствакцинальных антител к вирусу КЧС нет поствакцинальных антител к вирусу КЧС

Анализ содержания Ig. G и специфических антител в сыворотках крови 70 – сут. поросят Концентрация Ig. G < 8 мг/мл у 70% поросят нет поствакцинальных антител к вирусу РРСС и ЦВС-2 > 8 мг/мл выраженный уровень поствакцинальных антител к вирусу РРСС и ЦВС-2

Современные методы диагностики и профилактики вирусных болезней (на примере цирковирусных болезней свиней – ЦВБС) Цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) относящийся к Семейству Circoviridae (1995) Роду Circovirus (circular conformation) • синдром послеотъемного мультисистемного истощения (СПМИ); • синдром дерматита и нефропатии свиней (СДНС); • репродуктивные нарушения и респираторные болезни свиней

Частота обнаружения вирусных и бактериальных патогенов в легких поросят с респираторными болезнями (n=6335) Harms et al. , 2002; Choi et al. , 2003; Kim et al. , 2003; Chiou et al. , 2004

ЦВС-2 ДНК-содержащий ЦВС-2 Впервые выделен из тканей поросят с СПМИ в 1998 г. и Размножение – клетки иммунной системы (иммуносупрессия, развитие вторичных инфекций) Выделение со спермой – 47 дней Генотипы – ЦВС-2 a, ЦВС-2 b, ЦВС-2 c, ЦВС-2 d, ЦВС-2 e. Гомология между штаммами – 96% Наибольшая патогенность – ЦВС-2 b

Распределение различных генотипов ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ (результаты ПЦР в 2012 г. ) № Наименование хозяйства Количество проб, полученных из данного хозяйства Количество проб, положительных на ЦВС-2 1 «Снежка» , Брянская обл. 4 2 2 ООО Фирма «Мортадель» 20 3 - (генотип ЦВС-2 b) 3 ЗАО «Владимирское» 100 40 4 ЗАО «Северный Ключ» , Самарская обл. 9 7 5 ООО «Клинский» , Московская обл. 4 1 - (генотип ЦВС-2 b) 6 ЗАО свинокомплекс «Уральский» 19 6 - (генотип ЦВС-2 b) 7 «Северное» , г. Сургут 1 1 - (генотип ЦВС-2 b) 8 «Томский» 7 1 - (генотип ЦВС-2 b) 9 ЗАО свинокомплекс «Уральский» 20 3 - (генотип ЦВС-2 b) 10 ЗАО «Племзавод Юбилейный» 2 1 - (генотип ЦВС-2 b) 11 ООО Фирма «Мортадель» 24 8 - (генотип ЦВС-2 b)

Современные методы диагностики и профилактики ЦВБС l Профилактика: использование вакцин на основе ЦВС-2 (широкое применение во многих странах, например, «вакцинация поросят против ЦВС 2 обязательна для всех хозяйств-членов Австрийской ассоциации производителей свинины» - д-р Фердинанд Энтенфеллнер, Москва, 2013) Диагностика: РВ -ПЦР для определения ДНК ЦВС-2 (количественная оценка и определение генотипа) 2. ИФА для выявления антител к ЦВС-2 (традиционный и по определению/ дифференциации Ig. M-и Ig. G- специфических антител) l 1.

Вакцины против ЦВБС Страна Франция Производитель Вакцина Применение Merial CIRCOVAC Свиноматки: двукратно за 6 -7 и 3 -4 недели до опороса. Ремонтные свинки: за 2 недели до осеменения из инактивированного ЦВС-2 из химерного вируса (ЦВС-1 + ген ЦВС-2) США Fort Dodge Suvaxyn PCV 2 Поросята: с 4 недельного возраста Германия Boehringer Ingelheim Ingelvac Circo. FLEX Поросята: с 3 недельного возраста Голландия Intervet Schering Plough Circumvent PCV Porcilis PCV Поросята: с 3 недельного возраста Россия Ветбиохим ВЕРРЕС-ЦИРКО Поросята: с 2 недельного возраста Рекомбинантные субъединичные

Ig. M-, Ig. G-изотипы антител и диагностика цирковирусной инфекции свиней: новые практические аспекты

ELISA VALIDATION Ig. M > Ig. G Ig. M + Ig. M < Ig. G Results 1. 9% 2. 3% Interpretation Active infection Recent contact Ig G+ & Ig. M- 80. 5% Old contact Ig G- & Ig. M- 19. 5% No contact

МКА*к белку ORF-2, Рек. ORF-2 ЦВС-2 Ig. G-антитела к ЦВС-2 в сыворотке крови МКА к Ig. G свиньи МКА* к белку ORF-2 Рек. ORF-2 ЦВС-2 Ig. М –антитела к ЦВС-2 в сыворотке крови МКА к Ig. М свиньи

Май-июнь 2012 г. обследование хозяйств на ЦВС -2 -инфекцию Возраст поросят (n=5), сут 10 Ig. M + Ig. G + Отрицат. - - 5 40 2 - 3 80 - 1 4 90 - 4 1

Май-июнь 2012 г. обследование хозяйства на ЦВС-2 инфекцию у свиноматок (n=15) Ig. M + = Ig. G + Отрицат. - 2 9 4

Стратегия DIVA

Стратегия DIVA дифференциация инфицированных и вакцинированных животных 1999 - J. T. van Oirschot, Central Veterinary Institute, Нидерланды Вакцина + ИФА (использование ИФА на фоне вакцинопрофилактики) Стратегия основана на выявлении антител методом ИФА к антигенам, отсутствующим в вакцине

Стратегия DIVA: БОЛЕЗНЬ АУЕСКИ В большинстве стран мира с развитым свиноводством реализуются национальные программы по искоренению БА. При этом основное значение отводится использованию вакцины, маркированной по гену гликопротеина Е (g. E), кодирующего фактор вирулентности и соответствующего ИФА-набора, предназначенного для выявления антител к g. E-антигену вируса болезни Ауески.

Структура вириона герпесвирусов нет в вакцинном вирусе, но есть в вирулентном Назначение: дифференциация инфицированных от вакцинированных животных (при использовании вакцины, маркированной по гену гликопротеина Е, кодирующего фактор вирулентности). Принцип дифференциации основан на отсутствии антител к g. E-антигену у вакцинированных свиней и их наличии у инфицированных животных.

Антитела к g. B вируса БА + ИФА: «АУЕСКИ g. EСЕРОТЕСТ» отрицательный результат «АУЕСКИ g. ВСЕРОТЕСТ» положительный результат Маркированная по g. E вакцина против БА Антитела к g. E вируса БА -

Антитела к g. B вируса БА + ИФА: «АУЕСКИ g. EСЕРОТЕСТ» положительный результат «АУЕСКИ g. ВСЕРОТЕСТ» положительный результат вирулентный вирус БА Антитела к g. E вируса БА +

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !