Васильев Геннадий Владимирович Методы исследования уровня экспрессии генов

Васильев Геннадий Владимирович Методы исследования уровня экспрессии генов Институт цитологии и генетики СО РАН

Разделение РНК в денатурирующем геле по размеру Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр Отмывка от несвязавшегося зонда Результат авторадиографии Гибридизация с радиоактивно меченым зондом Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot) Преимущества метода Недостатки метода Довольно точная оценка экспрессии гена Сравнительный анализ нескольких образцов Возможность оценить не только наличие, но и размер транскрипта (транскриптов) Недостаточная чувствительность метода Необходимы довольно большие количества суммарной РНК Необходимость работать с радиоактивными изотопами. Редкие и слабо представленные РНК не выявляются, что может приводить к ложноотрицательному результату.

Представленность различных мРНК

Методы на основе ПЦР Количественный: ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) Качественные: Дифференциальный дисплей Неконкурентная мультиплексная ПЦР Полуколичественные: Конкурентная мультиплексная ПЦР Анализ с помощью микрочипов

Обратная транскриптаза Реакция обратной транскрипции – синтез кДНК по матрице мРНК поли A хвост 3’ мРНК oligo dT праймер кДНК Реакция обратной транскрипции

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция Наработка специфического продукта. Теоретицеский коэффициент размножения – 2 Реальный коэффициент размножения в хорошо оптимизированных условиях– 1,6-1,4.

Дифференциальный дисплей

Дифференциальный дисплей Преимущества метода Проведение сравнительного анализа Анализ экспрессии сразу большого количества генов Теоретически возможно идентифицировать все неизвестные транскрипты Низкая стоимость используемых реактивов Недостатки метода Получение качественных, а не количественных данных Большая трудоёмкость метода За счет конкуренции за dNTP и фермент не выявляются “редкие” малокопийные мРНК

относительный уровень экспрессии гена Неконкурентная мультиплексная ПЦР является методом относительной оценки экспрессии генов. Используют две пары специфических праймеров в одной реакции. В качестве контроля выступают гены, экспрессия которых слабо меняется в условиях эксперимента. Интенсивность полосы А Интенсивность контрольной полосы Неконкурентная мультиплексная ПЦР

Особенности ПЦР, искажающие количественные показатели Существование фазы «плато» Уровень плато определяется множеством параметров Высокая чувствительность метода Чувствительность ферментов к загрязнениям и изменению условий Низкая чувствительность метода детекции (окраска бромистым этидием). Для фрагментов длиной менее 300 п.н. детектируемые количества продукта нарабатываются уже в районе перегиба, а не в линейной фазе реакции Различия в эффективности амплификации фрагментов разной длины и разного нуклеотидного состава. При разнице эффективности амплификации двух фрагментов 5% изменение относительных концентраций уже на 25 цикле составит 3,6 раза. При 10% - 14 раз При 15% - 58 раз.

Конкурентная мультиплексная ПЦР Оба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же праймеров. Конкурентная ДНК добавляется в реакции серией заранее известных разведений

Мультиплексная ПЦР Преимущества метода Недостатки метода Довольно точная оценка экспрессии гена (возможно обнаружить двукратные различия при статистической обработке результатов) Метод достаточно дёшев, прост и быстр. Возможно оценить экспрессию редких и слабо представленных мРНК Требуется малое количество исходного материала Главный недостаток – сильная подверженность влиянию «синдрома китайского студента». Точность метода сильно зависит от квалификации и подготовки исследователя, что не является объективным критерием. На точности метода сильно сказываются недостаточно чувствительные методы детекции

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов Микрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными короткими фрагментами ДНК Олигонуклеотидные На основе участков кДНК

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов Преимущества метода Быстрый скрининг по большому количеству генов Наличие уже готовых панелей с различными целевыми наборами зондов. Возможность автоматизации процедуры Недостатки метода Слабая воспроизводимость Высокие уровни ошибок пере- и недопредсказания Результаты необходимо перепроверять методом Real-time PCR Цена

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) Детекция продукта производится в режиме реального времени по флуоресценции возбуждаемого лазером красителя непосредственно в реакционной смеси. Упрощённая модификация метода – использование интеркалирующего красителя SYBR-green. Образование целевого продукта отслеживается при построении кривой плавления. Высокая чувствительность метода позволяет гарантированно снимать показания на линейной части кривой, до выхода реакции на плато.

Преимущества метода Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов. Точный метод оценки уровня экспрессии гена Возможен сравнительный анализ экспрессии нескольких (до 4) генов в одной пробе при использовании разных флуоресцентных красителей Быстрота получения результата. Недостатки метода Сложности с выбором зондов Цена

SuperSAGE - serial analysis of gene expression Синтез кДНК Разрезание первой рестриктазой Лигирование с линкером, содержащим сайт Eco15I Рестрикция ферментом Eco15I Лигирование с образованием ди-тагов Приготовление библиотек Скавенирование

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования Синтез кДНК Лигирование и дробление Создание библиотек для секвенирования ПЦР в эмульсии Секвенирование Выравнивание и подсчёт копийности

Freed 2008 Метод, свободный от начальной гипотезы Быстрый и сравнительно недорогой скрининг транскриптома без предварительных его исследований. Возможность прямого сравнения экспрессии интересующих групп генов. Идентификация групп генов, скоординированно меняющих свою экспрессию. Наглядная классификация транскриптов по функциям и группам. Обнаружение кластеров скоординированно меняющих экспрессию генов, не связанных общей функцией Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования

Относительная обеднённость/обогащённость определёнными последовательностями в библиотеках для MPSS Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования

Факт для размышлений