Ультраструктура бактерий Сложные методы окраски Бактерии имеют

Ультраструктура бактерий Сложные методы окраски

Бактерии имеют строение, характерное для большинства прокариот В структуре бактериальной клетки выделяют основные и временные компоненты: основные компоненты: n Клеточная стенка n цитоплазматическая мембрана n цитоплазма n рибосомы n нуклеоид Временные структуры образуются лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий: n капсула n жгутики n пили n споры n

Ультраструктура бактерии

КАПСУЛА n n n Слизистый слой, покрывающий всю поверхность бактериальной клетки Капсулу образуют не все микроорганизмы. В зависимости от толщины слизистого слоя различают макрокапсулу (менее 0, 2 мкм), микрокапсулу (более 0, 2 мкм). защищает от фагоцитоза. защищает от неблагоприятных факторов внешней среды, поглощает влагу. Антигенная функция: К-АГ Адгезивная функция - служит средством прикрепления бактерий к субстрату

Метод окраски по Бурри-Гинсу n n черную тушь смешивают в культурой и высушивают. проводят фиксацию в пламени горелки окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5 -10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.

ЖГУТИК n n n n Подвижность бактерий Антигенная функция: Н-АГ. Жгутик состоит из трех частей: спиральной нити из белка флегелина, крюка базального тельца. Спиральная нить имеет Н-конец, обращенный к телу бактерии, и Т-конец, удаленный от тела бактерии. Крюк жгутика — изогнутый белковый цилиндр. Основное его назначение — соединительное звено между базальным тельцем и нитью. n Базальное тельце — сложная структура, состоящая из центральной оси и колец. n Обычно бактерии передвигаются хаотично, но возможно и направленное движение — таксис.

Строение жгутика грамотрицательных бактерий

ЖГУТИКИ БАКТЕРИЙ

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА n n n функции: Формообразующая, Защищающает повреждающих факторов окружающей среды, Тинкториальные свойства Участвует в обмене веществ (метаболизме), Антигенная: О-АГ

Метод Грама n n n На фиксированный мазок наливают один из осно вных красителей на 2— 3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) на 1— 2 минуты до почернения препарата. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20— 40— 60 секунд). Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1— 2 мин. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2— 5 мин). Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Метод Грама n Окраска по Граму Staphylococcus aureus (грамположительные кокки) и Escherichia coli (грамотрицательные бациллы)

Клеточная стенка грамположительных бактерий n n n на 80 -90 % она состоит из пептидогликана Она плотно прилегает к цитоплазматической мембране. Отличительной особенностью является наличие в клеточной стенке таких микробов тейхоевых кислот — полимеров глицерол- или рибитолфосфата, замещенных различными сахарами и Д-аланином Тейхоевые кислоты прочно связаны с пептидогликаном фосфоэфирными мостиками. тейхоевые кислоты обеспечивают биохимическую стабильность клеточных стенок грамположительных бактерий.

клеточная стенка грамотрицательных бактерий n n намного тоньше — 5 -15 нм. Пептидогликановый слой очень тонкий — 2 нм, он как бы «плавает» в периплазматическом пространстве, окруженном снаружи внешней мембраной, а внутри цитоплазматической мембраной или плазмолемой.

клеточная стенка грамотрицательных бактерий

Клеточная стенка грамположительных бактерий

Пептидогликан n n гетерополимер N-ацетилглюкозамин N-ацетилмурамовая кислота сшиты через лактатные остатки Nацетилмурамовой кислоты короткими пептидными цепочками

Пептидогликан n n n упорядоченная структура ячеистого строения N-ацетилглюкозамина и Nацетилмурамовой кислоты, соединенных β-1, 4 -гликозидными связями. Остатки N-ацетилмурамовой кислоты сшиты между собой при помощи коротких пептидов (сшивка производится ферментом транспептидаз ой). пептидная цепочка содержит L-аланин, D-аланин, L-лизин, D-глутаминовая кислота, мезодиаминопимелиновая кислота (в составе клеточных структур встречаются только в прокариотических клетках). Такая трёхмерная структура сообщает клеточной стенке бактерий прочность и защиту от осмотического лизиса. Структура пептидогликана E. coli

Бактерии лишенные клеточной стенки: протопласты, сферопласты, L-формы Основные причины возникновения: n Действие литических ферментов, n Действие антибиотиков пенициллинного ряда n Взаимодействие бактерии с вирусами бактерий — бактериофагами.

n Протопласт (от др. -греч. πρῶτος — «первый» + πλαστός — образованный, вылепленный и др. ) — содержимое растительной или бактериальной клетки, за исключением внешней клеточной оболочки (клеточной стенки), однако при сохранении клеточной (плазматической) мембраны.

n n n Сферопласт (от греч. sphaira шар и plastos- созданный, образованный)— бактериальная клетка с частично разрушенной (редуцированной) клеточной стенкой, характеризующаяся неустойчивостью к изменениям осмотического давления. В гипертоничной среде принимают сферическую форму В изотоничных средах могут размножаться и осуществлять множественные метаболичные реакции, характерные для

n L-формы — бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию.

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА Неотъемлемая часть любой бактериальной клетки. n Разрушение плазмолеммы неизбежно приводит к гибели микроорганизма. n Химический состав цитоплазматической мембраны представлен на 75 % белками и на 15 % липидами. n Способна образовывать выпячивания, или инвагинации, которые называются мезосомами. n Осмотический барьер клетки, благодаря своей полупроницаемости она способна контролировать поступление питательных веществ в клетку n Является местом протекания различных реакций Структурно цитоплазматическая мембрана состоит из трех слоев: n двух липидных и одного белкового n

ЦИТОПЛАЗМА n n Внутренняя среда клетки Основные жизненные процессы

Рибосомы n Синтез белка

Нуклеоид n n n n двойная нить ДНК, замкнутая в кольцо РНК-полимераза собственно РНК белки липиды отсутствие ядерной оболочки геном бактерии заключен в одной хромосоме хромосома микроорганизмов всегда связана с цитоплазматической мембраной, при этом число точек прикрепления может быть около 20 и более

Включения n n Не обязательный компонент бактериальной клетки Принято различать 2 типа включений: ограниченные белковой мембраной и лишенные мембран Запас питательных веществ Зерна Волютина: Волютин способен раствориться в щелочах и горячей воде.

Окраска по Нейссеру n Зерна волютина

Серебрение по Морозову n n n Реактив I: к 100 мл дистиллированной воды добавляют 2 мл 40% раствора формалина и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Реактив II: 100 мл дистиллированной воды объединяют с равным объемом жидкой карболовой кислоты и в них растворяют 5 г х. ч. танина. Реактив III: в 100 мл дистиллированной воды растворяют 5 г кристаллического нитрата серебра. К приготовленному раствору по каплям добавляют насыщенный раствор аммиака до тех пор, пока образующийся при этом желтоватокоричневый переходящий в буровато-черный осадок не растворится, оставив легкую опалесценцию. Рабочее разведение реактива 1: 10 дистиллированной водой. Техника окраски. Тонкий препарат, приготовленный из тканевой жидкости, подлежащей исследованию, высушивают в термостате при температуре 37 °С. На сухой препарат наливают 5— 10 капель реактива I, через 1 мин реактив I сливают и препарат промывают дистиллированной водой. На препарат наслаивают реактив II и подогревают на пламени горелки до появления паров, затем тщательно промывают препарат водой и наносят реактив III так, чтобы он покрыл всю поверхность препарата. Предметное стекло вновь подогревают в течение 2— 3 мин до тех пор, пока окраска мазка не станет темно-коричневой. После тщательного промывания

МЕТОД ЛЁФЛЕРА n n Взвесь исследуемой агаровой культуры ставят в термостат на 10— 20 мин. неск. капель взвеси наносят на прокалённое чистое предметное стекло, высушивают на воздухе и фиксируют, проводя через пламя горелки. Фиксированный препарат погружают на 0, 5— 2 мин в протраву (её состав: 20%-ный р-р танина — 100, 0 мл, насыщенный на холоде р-р сернокислого железа — 50, 0 г, насыщенный спиртовой р-р фуксина — 10, 0 г). Затем препарат промывают водой, высушивают и окрашивают анилиновым фуксином Эрлиха в течение 2— 3 мин, снова промывают, высушивают и просматривают под микроскопом

ПИЛИ n Пили (фимбрии) представляют собой прямые тонкие (3 -25 нм) полые выросты длиной до 15 мкм на поверхности бактериальной клетки. Основу пилей составляет белок пилин. n Различают два типа пилий: n общего назначения половые (sex-пили) предназначены для прилипания микробов к субстрату (клеткам растений, грибов, животных и человека, а также неорганическим соединениям). необходимы для обмена генетической информацией (ДНК) между клеткойдонором и клеткойреципиентом.

СПОРЫ И СПОРООБРАЗОВАНИЕ n n n Споры образуют только грамположительные палочки Споры рассматриваются как особый тип покоящихся клеток. Одна клетка образует только одну спору.

Строение спор n n В центре располагается спороплазма, содержащая нуклеиновую кислоту, белки и специфическую для спор дипиколиновую кислоту. Спороплазма окружена многочисленными оболочками, самая массивная из них носит название «кортекс» .

Спорообразование n 1) образование осевого тяжа, включающего бактериальную ДНК; 2) образование круглой проспоры; 3) образование толстого муреинового слоя — кортекса; 4) окончательное обособление споры.

Окраска по Ожешко n Мазок из чистой культуры Bacillus pseudoanthracis • На высушенный мазок наливают 0, 5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1 -2 мин. • Препарат промывают водой и фиксируют над пламенем горелки. • Окрашивают по способу Циля. Нильсена.

метод Циля–Нильсена n n Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё феноловый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2— 3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 25%-го раствора серной кислоты или 3% солянокислого спирта в течение 3 -х минут, и промывают несколько раз водой. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 1 минуту, промывают водой и высушивают. При окраске по методу Циля — Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

метод Циля–Нильсена n Изображение Mycobacterium tuberculosis, полученное с помощью метода Циля — Нельсена

Метод темного поля n n n освещение объекта полым конусом света Свет в таком случае направляется на объект специальным конденсором темного поля лучи света проходят через препарат и образуют пучок в виде полого конуса, при этом лучи не попадают в объектив (так как объектив находится внутри этого конуса) Данный метод контрастирования применяется при изучении прозрачных объектов, которые применении метода светлого поля не видны. Такой метод подойдет для изучения живых неокрашенных биологических образцов, например, простейших или отдельных живых клеток.

Ход лучей в темнопольном конденсоре n Кардиоид-кондесор n Параболоид-конденсор

Метод фазового контраста n n n используется для изучения прозрачных и бесцветных образцов, которые не могут быть рассмотрены методом светлого поля, неокрашенные животные ткани. Метод основан на различиях показателях преломления элементов образца, при этом глазом воспринимаются изменения яркости (так называемый "фазовый рельеф"). Для получения фазово-контрастного изображения используются объективы со специальными фазовыми пластинками, конденсоры с поворачивающимся диском. В результате использования данного метода получают либо позитивный фазовый контраст (изображение темных организмов на светлом фоне) или негативный фазовый контраст (изображение светлых организмов на темном фоне). применении метода темного поля выявляются только лишь контуры объекта, то метод фазового контраста дает возможность рассмотреть элементы внутренней структуры.

Световая микроскопия, окраска 1% раствором метиленового синего. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus Cereus на плотной питательной среде (в камере М. А. Пешкова) Использование техники микроскопии в темном поле. В центре изображена бледная трепонема

Окраска по Грамму Исследуемый материал Ингредиенты окраски Смесь палочек и Генцианвиолет, кокков 1 -2 мин. Водный р-р Люголя, 1 мин. Этиловый спирт, 30 -60 с. Вода (промывают) Водный раствор фуксина Назначение основных ингредиентов Результат с обозначениями