трансплантация эмбрионов у кроликов Подготовил – Васин Я. П. 1 гр.
Вступление • Кролик был важным животным в изучении репродуктивной биологии , поскольку Уолтер Хейп совершил первый успешный эксперимент переноса эмбрионов кроликов около 100 лет назад ( процитировал Бигерс , 1991). Были разработаны многочисленные методы получения хирургического доступа к яичникам , маточным трубам , матки и влагалища с флангов или белой линии ( Chang , 1950 ; Хафез , 1962 ; Adams , 1962 ).
• Такие хирургические методы для получения доступа в брюшную полость давали возможность наблюдения и переноса эмбрионов, однако создавали стресс для животного-реципиента. Кроме того, манипуляции половых органов могли привести к кровотечению или рубцовому образованию, которое снижает эффективность переноса эмбриона. Фудзимото и др ( 1974 ) использовали метод эндоскопии ( Russel , 1988 ) , чтобы наблюдать созревание фолликула и овуляцию у кроликов.
• Этот метод также был использован для измерения точности скорости овуляции ( Theau - Kliment и Bolet , 1987; Santacreu и др , 1990) и оценить скорость имплантации на 12 -й день беременности ( Santacreu и др , 1990 ). Theau - Kliment и Bolet ( 1987 ) и Santacreu и др ( 1990 ) также отметил , что использование лапароскопии не оказывают негативное влияние на выживаемость плода. Viudes de Kastro и др ( 1991 ) использовали следственную хирургии для изучения влияния калорийности пищи на скоростях овуляции , имплантации и потери плодов и пришли к выводу , что лапароскопия имеет неоценимое значение для определения влияния диет на течки и уровень рождаемости.
Цели • Цель данного исследования состояла в том , чтобы разработать новый , упрощенный подход к передаче эмбрионов в маточных трубах кролика. Здесь показываются удволетворительные показатели беременности и имплантации в результате уменьшение обработки и стресса для кролика в сочетании со значительно меньшими манипуляциями над репродуктивными органами
Материалы и методы • Было использовано тридцать одна крольчиха ; Они были в отдельных клетках и одинаковом светом режиме - 14 ч свет : 10 ч темно , в течении 3 недель до начала эксперимента. Кролики получали гранулированный корм , который содержал ( 17, 5 % белка, 2, 0 % жира , 14 % клетчатки , 8, 0 % золы , 20 000 IU витамина А, 800 МЕ витамина D 3 , 40 мг витамина Е и 25 мг меди) К воде – неограниченный доступ. Испытания были начаты в августе 1991 года и закончилась в апреле 1992 года.
• Семьдесят два часа до индукции овуляции, доноры животные получали сыворотку гонадотропина жеребных кобыл (20 МЕ/1 кг ГСЖК внутримышечно) Овуляция была вызвана в. в. введение 180 МЕ Ekluton (синтетическим прогестагеном )на одно животное. Эмбрионы – 2 мя, 3 мя, 4 мя бластомерами или в стадии Морулы. Неоплодотворенные были отброшены. Перенос эмбрионов был осуществлен в течении 22 -24 ч после синхронизации животныхреципиентов. Для мітья и зранения ємбрионов біло использованно – фосфатно-солевой буфер Дульбеко, которым и обмывали эмбрионы
Фаза 1 • В этой фазе 9 средних по размеру кроликов гибридов (9 -12 месяцев и 4 -5 кг) были использованы для эндоскопической пересадки эмбрионов. Каждый реципиент получи по 30 -54 эмбриона на разных стадиях развития. 6 животных были забиты , для определения успешности оплодотворения. Оставшиеся 3 кролика оставили для дальнейшего вынашивания.
Фаза 2 • Во второй стадии каждому кролику пересадили 10 – 12 эмбрионов на разных стадиях развития. Всего было задействовано 22 кролика (4 -5 месяцев, 3, 54, 5 кг) Эмбрионы использованные в этот раз были с 1 й, 1 -2 и 2 мя бластомерами. Все реципиенты забеременили.
• В обеих стадиях , как в левую так и в правую маточные трубы, было введено одинаковое количество эмбрионов.
Инструменты • Для эндоскопического переноса эмбрионов были использованны следующие инструменты : Не большой cold light fountain 150 ват, оптико- волоконній кабель , светонакопительные лампы, инфильтрационный троакар с автоматическим клапоном и пирамидальным наконечником (диаметр 4, 5 мм), Ендоскоп Хопкинса 4, 5 мм с углом поворота 30 °.
Проведение операции • Кроликов реципиенты анестезировали в. в. инъекции ксилазина-кетамина (1, 8 мг/1 кг ксилазина, 2% и 15 мг кетамина гидрохлорид/1 кг 10%, . Пупковую область кролика выбривали, затем укладывали на передвижном операционном столе в вертикальном положении (головой вниз). После того, как был сделан небольшой разрез (<1 см), эндоскоп троакар был введен через брюшную стенку. После удаления троакара, живот был раздут. Затем был вставлен эндоскоп (см. Рис. 1) Вертикальное расположение животного гарантирует, что желудок и кишечник краниально расположены таким образом, что маточные трубы образуют петлю вниз оказывающуюся между яичников и матки. Проксимальный конец ампулы проходит по прямой линии (2 -3 см) над воронкой. Среду, содержащую эмбрионы переносили с помощью стеклянного капилляра (5 μ колпачками, Бранд, Вертхейм) в ампулу через воронку (рис 2. ). После этого воздух удаляется из брюшной полости и разрез закрывают с помощью зажимаl. Животного-реципиента исследовали при помощи пальпации на 12 -й день после овуляции, чтобы определить, была ли она беременна. Частота имплантации определялась как процент эмбрионов, которые были имплантированы, а также процент выживаемости эмбрионов, а также процентное соотношение переданных животному эмбрионов из которых вышло здоровое потомство.
Итоги • Разработаная методика эндоскопической пересадки эмбрионов на ранних стадиях развития , состоящих из 2 х, 3 х, 4 х бластомеров или в стадии морулы является наиболее успешной. Методика была разроботанная в 2 стадии. Первый этап экспериментов включал передачу 30 – 65 эмбрионов каждому из девяти реципиентов. В результате беременности у всех животных наблюдалась беременность. Через 12 дней шесть кроликов из 9 были убиты , и они показали успешность имплантации 27%. Оставшиеся три кроликов продолжались беременности до родов. Выживаемость эмбрионов составила 26%. На втором этапе , 10 – 20 эмбрионов были переданы каждому из 22 животных-реципиентов , 19 из которых разродились ( выживаемость эмбрионов у забеременевших животных составила 47% ). Что в свою очередь доказало , что при правильном подходе к этой процедуре , можно достич высоких показателей выживаемости , а также к дальнейшей экономической выгоде.
Скачать презентацию трансплантация эмбрионов у кроликов Подготовил Васин Я
трансплантация эмбрионов у кроликов.pptx