ТРАНСКРИПЦИЯ Лекция-семинар 2 Регуляция транскрипции 1 Обсуждаем

ТРАНСКРИПЦИЯ Лекция-семинар 2. Регуляция транскрипции 1

Обсуждаем: Транскрипционные факторы эукариот- особенности строения и взаимодействия с ДНК Как определить размеры промотора? 2

Транскрипционные факторы 3

Действие ТФ 4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

Mechanism of action 24 Modified from Figure 7 -49 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Кластеры генов объект авторы DAL 1 – DAL 4 – DAL 2 Saccharomyces cerevisiae Cooper, Lawther, 1974 GAL 7 -GAL 10 -GAL 1 Saccharomyces cerevisiae prn. A-prn. D-prn. Bprn. C 25 Douglas, Hawthorne, 1964 Arst, Mc. Donald, 1975 Aspergillus nidulans

Подходы к изучению регуляции экспрессии генов 1. Генетический – отбор и анализ мутантов и выяснение эпистатических взаимодействий 2. Молекулярно-биологический – исследование структуры генов, выделение регуляторных белков и поиск их мишеней, анализ белок-белковых и белок-ДНК взаимодействий 3. Анализ транскриптомов 4. Разработка принципов интеграции различных регуляторных цепей 26

Генетический контроль метаболизма углеводов 27

28

29

В клетках опухоли возрастает уровень фосфофруктокиназы ( с очень высоким 30 сродством к глюкозе) и лактатдегидрогеназы

Метаболизм углеводов у дрожжей и его регуляция Ферментация: Брожение — это анаэробный метаболический распад молекул питательных веществ, например, глюкозы Дрожжи S. cerevisiae факультативные анаэробы 31

Yeast Metabolism 32

Диауксический шифт 33

Pfk 1 – гетерооктамер, состоит из субъединиц альфа (PFK 1) и бета (PFK 2) Пируват киназа определяет скорость гликолиза и направляет поток метаболитов 34

Глюкоза в среде Индукция генов, кодирующих переносчики глюкозы и ферменты гликолиза 35 Глюкозная катаболитная репрессия генов, кодирующих ферменты, необходимые для усвоения других сахаров

36

Белки, участвующие в регуляции глюкозного обмена Mth 1 –негативный регулятор пути переноса сигнала о концентрации глюкозы в среде. Необходим для репрессии транскрипции генов HXT , белком репрессором Rgt 1 p; Взаимодействует с Rgt 1 p и сенсорами глюкозы Snf 3 p и Rgt 2 p; Фосфорилирование Mth 1 p киназой Yck 1 p запускает его деградацию; MTH 1 имеет паралог STD 1, который возник в результате полногеномной дупликации Std 1 – белок взаимодействует с Snf 1 p, сенсорами глюкозы Snf 3 p и Rgt 2 p; регулятор транскрипционного фактора Rgt 1 p; 37

Ответ клетки на глюкозу в среде Rgt 1 может быть и активатором и репрессором. Rgt 1 совместно с Mth 1 и Std 1 репрессирует гены HXT, кодирующие транспортеры глюкозы. Освобождение промоторов от Rgt 1 некоторых генов HXT требует активности c. AMP-зависимой пртеинкиназы (PKA) 38

Системы транспорта глюкозы у дрожжейсахаромицетов Система транспорта Конститутивная (с низким сродством к глюкозе) белки Фенотип мутанта При высокой концентрации Только мутации по всем 7 глюкозы – Hxt 1 и Hxt 3 генам HXT ведут к неспособности расти на глюкозе Репрессируемая глюкозой В среде, где глюкозы мало ( с высоким сродством к синтезируются Hxt 6 –Hxt 7, глюкозе) при повышении концентрации – Hxt 2 и Hxt 4 Сенсоры глюкозы – мембранные белки 39 Rgt 2 - сенсор высокой концентрации глюкозы Snf 3 –сенсор низкой концентрации глюкозы Штамм snf 3 rgt 2 – дефектен в глюкозной индукции генов HXT

The glucose induction pathway of the HXTgenes and its components. Grr 1 – убиквитинлигаза Özcan S , Johnston M Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999; 63: 554 -569 40

Rgt 1 Имеет ДНК-связывающий домен (Cys 6 Zn 2 ) В отличие от Gal 4 p, не имеет домена димеризации и связывается с ДНК в виде мономера Бифункциональный ТФ – если нет глюкозы – репрессор, много глюкозы – активатор, низкий уровень – нейтральный фактор. Rgt 1 регулирует экспрессию генов, кодирующих белки-переносчики глюкозы и не влияет на экспрессиию генов, кодирующих ферменты гликолиза 41

Rgt 1 – регулятор генов, контролирующих белки – переносчики глюкозы привлекает комплекс ко-репрессора Tup 1 -Ssn 6 Rgt 1 42

Глюкозная индукция Активация генов гликолиза 43

Pfk 1 – гетерооктамер, состоит из субъединиц альфа (PFK 1) и бета (PFK 2) Пируват киназа определяет скорость гликолиза и направляет поток метаболитов 44

Формы гексокиназы у дрожжей Гексокиназа II мономер + глюкоза Не фосфорилирована (активна) - глюкоза Фосфорилирована (не активна) Фосфатазы 45 димер Reg 1 p, Glc 7 p

46

Ферменты, катализирующие необратимые реакции гликолиза Фосфофруктокиназа Pfk 1 (Pfk 1 и Pfk 2) ( в норме ингибируется цитратом и АТФ, при раке- нет) Пируваткиназа Pyk 1 – определяет скорость гликолиза. Мишень для антираковой терапии. 47

Основные регуляторы транскрипции генов, индуцируемых глюкозой Rap 1 Gcr 1 - Gcr 2 – взаимодействует с Gcr 1 и активирует только гены гликолиза 48

Rap 1 • 92, 4 k. Da • Активатор генов гликолиза и генов белков рибосом • Связывается с несколькими сотнями промоторов • репрессор локусов типа спаривания и удлинения теломер • Гликолиз регулирует в комплексе с Gcr 1/Gcr 2 • RPG-box – ACCCATACATTTA • Узнает и активирует 294 гена у дрожжей ( 5% генов) 49

Роль белка-активатора Gcr 1 в координации гликолиза и процессов трансляции и клеточного цикла 5’-CTTCC-3’ гомодимер 50

Pfk 1 – гетерооктамер, состоит из субъединиц альфа (PFK 1) и бета (PFK 2) Пируват киназа определяет скорость гликолиза и направляет поток метаболитов 51

Роль белка-активатора Gcr 1 в координации гликолиза и процессов трансляции и клеточного цикла 52

Глюкозная катаболитная репрессия Уровни регуляции ГКР- чувствительных ферментов 1. Транскрипция 2. Трансляция ( изменение скорости трансляции – Adr 1 p; изменение стабильности и. РНК - cтабильность и. РНК MAL 63 – c 25 минут до 6 минут. 3. Протеолитическая деградация – добавление глюкозы в среду приводит к быстрому фосфорилированию и деградации некоторых ферментов, например фруктозо-1, 6 -дифосфатазы. 53

Глюкозная катаболитная репрессия ( Carbon Catabolite Repression) Для поиска генов, контролирующих CCR, отбирали мутантов, не чувствительных к глюкозной репрессии, а также мутантов не способных к индукции при отсутствии глюкозы в среде/ Reg 1 -Reg 2 -Glc 7 – комплекс протеинфосфатаз Snf 1 -Snf 4 = комплекс киназы SNF 1 Mig 1 –Ssn 6 -Tup 1 – комплекс репрессора 54

Репрессор Mig 1 MIG 1 - кодирует белок, репрессор генов ГКР. Мутации в этом гене являются супрессорами мутаций snf 1 и snf 4. Белок Mig 1 р имеет цинксодержащий домен С 2 Р 2 и связывается с 55 последовательностью ДНК «GC-бокс» -(G/C)(C/T)GGGG Гибридный белок Lex. А-Mig 1 регулирует экспрессию репортерных генов, находящихся под контролем нескольких Lex –операторов, в зависимости от концентрации глюкозы. При росте на глюкозе их транскрипция репрессирована, снижение концентрации глюкозы приводит к ослаблению репрессии, а на среде с галактозой репрессии нет. Mig 1 p фосфорилируется протеинкиназой Snf 1 p. В штаммах, содержащих мутацию snf 1, гены ГКР репрессированы даже на среде без глюкозы. В то же время, по-видимому, Snf 1 p является не единственной киназой, которая фосфорилирует Mig 1 p (Schuller, 2003). Mig 1 p привлекает к промоторам репрессивный комплекс Tup 1 p-Сyc 8 (Ssn 6) и, тем самым, блокирует транскрипцию

Модель регуляции активности репрессора Mig 1 в зависимости от наличия глюкозы в среде (Schuller, 2003) NLS – (nuclear localization sequence) последовательность, обеспечивающая ядерную локализацию, NES – (nuclear export sequence) последовательность, необходимая для экспорта белка из ядра 56

Регуляция активности комплекса SNF 1 АТФ>АМФ АМФ>АТФ Snf 1 –каталитическая субъединица (альфа) Sip 1, Sip 2, Gal 83 (бета-субъединицы) – необходима для распознавания субстратов киназы Snf 4 – (гамма субъединица) – связывается с производными аденозина, сигнал для прекращения автоингибирования ( АМФ: АТФ) 57

58

Роль Snf 1 в активации генов , регулируемых ССR 59

60

61

62

63

64

A simplified schematic representation of the three wellcharacterized glucose-response pathways in S. cerevisiae. (a) The main glucose repression pathway. In response to high glucose concentrations, the complex containing the Snf 1 kinase inhibits the Mig 1 repressor-containing complex and thus represses genes involved in respiration, gluconeogenesis and the metabolism of alternative carbon sources, such as galactose (GAL genes) and maltose (MAL genes). Protein phosphatase type 1 (PP 1) acts in a complex with Reg 1 to downregulate Snf 1 in low-glucose conditions. Glucose phosphorylation by Hxk 2 is required for this pathway, but the step at which it acts is not known. (b) The Snf 3/Rgt 2 glucose-sensing pathway. In the absence of glucose, Rgt 1 acts in a complex with Std 1 and Mth 1 as a transcriptional repressor of the HXT 1 -HXT 4 genes. When glucose is present, the transcription factor Rgt 1 is inactivated through SCF-Grr 1 -mediated inactivation and degradation of Mth 1 and Std 1, and hyperphosphorylation by an unknown kinase, resulting in dissociation of Rgt 1 from the HXT promoters. Snf 3 triggers the induction of HXT 1 -HXT 4 in response to low glucose concentrations. High glucose concentrations further enhance HXT 1 expression through Rgt 2 in a process that involves conversion of Rgt 1 into a transcriptional activator. (c) The Gpr 1/Gpa 2 glucose-sensing pathway. High glucose concentrations activate c. AMP synthesis by the adenylate cyclase Cyr 1 (which is dependent on Ras) through the Gpr 1/Gpa 2 G-protein-coupled receptor system in a glucose-phosphorylation-dependent manner. The resulting activation of protein kinase A (PKA) affects a wide variety of target genes involved in, for example, carbon metabolism and stress resistance. Some of these effects are mediated by the Msn 2 and Msn 4 transcription factors. STRE, stress-response element. See text for further details. Geladé et al. Genome Biology 2003 4: 233 doi: 10. 1186/gb-2003 -4 -11 -233 65

66

67

Galactose transport= Gal 2 p, Galactose to galactose 1 -p = Galactose kinase, (GAL 1) Galactose 1 -p to UDP-Glucose= GAL-UDP transferase (Gal 10) UDP Glucose is converted to Glucose 1 -p by epimerase (GAL 7) Glucose 1 -p is converted to Glucose 6 -p by GAL 5 -p. 68

GAL 1, GAL 7, GAL 10 - Chr. II Регуляторы: GAL 4 - Chr. XVI, GAL 80 -Chr. XIII GAL 3 - Chr. IV Регуляторные белки регулируют более 22 генов GAL-7 P GAL-10 P P GAL-1 <-----------I------I<-----------I-----I----------> 69

70

71 GAL 1 promoter elements: -------UAS 1 -UAS 2 -UAS 3 -UAS 4 ----URS------TATA--In. R---DPE GAL 4 gene promoter elements: -------UAS------UES----urs(Mig)-----+1>----DPE-- UAS = Upstream activator sequences, URS = Upstream regulator / repressor sequences,

72

Механизм глюкозной репрессии 73 In the presence of glucose the GAL 1 gene is blocked Mig 1 which binds to Tup.

Galactose transport= Gal 2 p, Galactose to galactose 1 -p = Galactose kinase, (GAL 1) Galactose 1 -p to UDP-Glucose= GAL-UDP transferase (Gal 10) UDP Glucose is converted to Glucose 1 -p by epimerase (GAL 7) Glucose 1 -p is converted to Glucose 6 -p by GAL 5 -p. 74