Скачать презентацию Транскрипция ДНК РНК ГЕН Законы Менделя 0 Скачать презентацию Транскрипция ДНК РНК ГЕН Законы Менделя 0

Ter_Transkriptsia.ppt

  • Количество слайдов: 96

Транскрипция ДНК РНК Транскрипция ДНК РНК

ГЕН Законы Менделя 0 0 I Х © Mendel Museum of Genetics www. mendelmuseum. ГЕН Законы Менделя 0 0 I Х © Mendel Museum of Genetics www. mendelmuseum. muni. cz Грегор Иоганн Мендель (Gregor Johann Mendel) 1822 -1884 1. Закон единообразия гибридов первого поколения У потомков первого поколения от скрещивания родителей, имеющих два варианта одного признака (н-р, цветков), будет присутствовать только один вариант (доминантный) этого признака. Непроявившийся вариант – рецессивный. I I II II Х 2. Закон расщепления признаков Во втором поколении (полученном с помощью скрещивания потомков первого поколения) появляются оба варианта признака в соотношении доминантный: рецессивный = 3: 1. www. agroatlas. ru

ГЕН Законы Менделя 0 0 I Х II II II 3. Закон независимого наследования ГЕН Законы Менделя 0 0 I Х II II II 3. Закон независимого наследования признаков Варианты одного признака проявляются в потомстве независимо от вариантов другого признака, и их проявление подчиняется 1 -му и 2 -му закону. Mendel, Gregor. Versuche über Plflanzenhybriden. Verhandlungen des naturforschenden Vereines in Brünn, Bd. IV für das Jahr 1865, Abhandlungen, 3 -47. Дискретный наследственный фактор

ГЕН Эксперимент Гриффита (1928) Streptococcus pneumoniae Тип S Тип R Infection and Immunity. -2006. ГЕН Эксперимент Гриффита (1928) Streptococcus pneumoniae Тип S Тип R Infection and Immunity. -2006. -V. 74. -No. 8. : 4486 -4495 profiles. nlm. nih. gov Фредерик Гриффит (Frederick Griffith) 1879 -1941 Трансформация бактерий

ГЕН Эксперимент Херши-Чейз (1952) ДНК Хвостовые фибриллы Белковая капсула (головка) Стержень Чехол Memorial University ГЕН Эксперимент Херши-Чейз (1952) ДНК Хвостовые фибриллы Белковая капсула (головка) Стержень Чехол Memorial University of Newfoundland www. mun. ca Марта Чейз (Martha Cowles Chase) 1927 -2003 Базальная пластинка Бактериофаги атакуют E. coli © Science Photo Library www. sciencephoto. com Центрифугирование Мечение 35 S (метится белок) Инфицирование Мечение 32 P (метится ДНК) Альфред Херши (Alfred Day Hershey) 1908 -1997 Метка в осадке (в бактериях) Метка в супернатанте (в вирусах)

ГЕН Единица наследственности (и мутагенеза) – ограниченный в пространстве участок генома (ДНК или РНК), ГЕН Единица наследственности (и мутагенеза) – ограниченный в пространстве участок генома (ДНК или РНК), ответственный за проявление определенной функции (белка или РНК).

Цистрон А Цистрон Б Цистрон – локус генома (участок ДНК), ответственный за образование белка Цистрон А Цистрон Б Цистрон – локус генома (участок ДНК), ответственный за образование белка (РНК) Цистрон А Цистрон Б Транскрипция Транскрипт А

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы Элемент – участок ДНК, влияющий на транскрипцию +1 Транскрипт +1 cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы Элемент – участок ДНК, влияющий на транскрипцию +1 Транскрипт +1 +1 +1 сis-элемент – участок той же молекулы ДНК, с которой считывается целевой транскрипт

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы +1 Транскрипт +1 +1 +1 trans-элемент – участок молекулы ДНК, cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы +1 Транскрипт +1 +1 +1 trans-элемент – участок молекулы ДНК, с которой не считывается целевой транскрипт

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы Фактор – молекула не. ДНКовой природы, влияющая на транскрипцию +1 cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы Фактор – молекула не. ДНКовой природы, влияющая на транскрипцию +1 Транскрипт с trans-элемента trans-элемент trans-фактор +1 Транскрипт

Транскрипция Промотор +1 5’-нетранскрибируемый Участок ДНК Промотор обеспечивает корректное начало и направление транскрипции Удаление Транскрипция Промотор +1 5’-нетранскрибируемый Участок ДНК Промотор обеспечивает корректное начало и направление транскрипции Удаление промотора приводит к сильному подавлению транскрипции, началу транскрипции со случайных точек и в любом направлении

Цистрон окружен cis-элементами, необходимыми для его регуляции Промотор Терминатор cis-элементы Цистрон А Цистрон Б Цистрон окружен cis-элементами, необходимыми для его регуляции Промотор Терминатор cis-элементы Цистрон А Цистрон Б Цистрон В РНК А РНК Б РНК В

Генетическая регуляция синтеза ферментов, информационная РНК и оперон © The Nobel Foundation Франсуа Жакоб Генетическая регуляция синтеза ферментов, информационная РНК и оперон © The Nobel Foundation Франсуа Жакоб Андре Мишель Львов Жак Люсьен Моно (François Jacob) (André Michel Lwoff) (Jacques Lucien Monod) 1920 г. р. 1902 -1994 1910 -1976

Оперон Цистроны Промотор Терминатор Цистрон А Цистрон Б Цистрон В Цистрон Г Цистрон Д Оперон Цистроны Промотор Терминатор Цистрон А Цистрон Б Цистрон В Цистрон Г Цистрон Д Оперон – локус генома (участок ДНК), ответственный за образование нескольких белков (РНК) одновременно РНК АБВГД РНК А РНК Б РНК В РНК Г РНК Д

Lac-оперон Основной источник энергии для бактерий D-Глюкоза При замене глюкозы на лактозу в бактериях Lac-оперон Основной источник энергии для бактерий D-Глюкоза При замене глюкозы на лактозу в бактериях появляются 3 фермента Лактоза β-галактозид пермеаза – обеспечивает проникновени лактозы в клетку β-галактозидаза (гидролаза) – гидролизует О-гликозидную связь β-галактозид трансацетилаза (трансфераза) – ацетилирует лактозу +

Lac-оперон Lac. Z Промотор Оператор (cis-элемент) Lac. Y Lac. A Терминатор Lac. Y – Lac-оперон Lac. Z Промотор Оператор (cis-элемент) Lac. Y Lac. A Терминатор Lac. Y – кодирует β-галактозид пермеазу Lac. Z – кодирует β-галактозидазу Lac. A – кодирует β-галактозид трансацетилазу В среде без лактозы Lac. Z Lac. Y Lac. A РНК-полимераза Репрессор В среде с лактозой ( ) РНК-полимераза и. РНК (м. РНК) Репрессор β-галактозидаза β-галактозид пермеаза β-галактозид трансацетилаза

ТРАНСКРИПЦИЯ реализация генетической информации ТРАНСКРИПЦИЯ реализация генетической информации

Транскрипция ДНК-зависимая РНК-полимераза и РНК-зависимая ДНК-полимераза РНК-полимераза (трансфераза) матрица ДНК + РНК АТФ УТФ Транскрипция ДНК-зависимая РНК-полимераза и РНК-зависимая ДНК-полимераза РНК-полимераза (трансфераза) матрица ДНК + РНК АТФ УТФ ГТФ ЦТФ 4 x. PPi ДНК-полимераза (трансфераза) матрица РНК + ДНК д. АТФ д. ТТФ д. ГТФ д. ЦТФ 4 x. PPi

Транскрипция РНК-полимераза © The Nobel Foundation Нобелевская премия 1959 г. «За открытие механизмов биосинтеза Транскрипция РНК-полимераза © The Nobel Foundation Нобелевская премия 1959 г. «За открытие механизмов биосинтеза рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты»

Транскрипция РНК-полимераза Фракция, обогащенная белком Добавляем фракцию, обогащенную белком Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Инкубируем Транскрипция РНК-полимераза Фракция, обогащенная белком Добавляем фракцию, обогащенную белком Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Инкубируем Экстракт ткани Удаляем нуклеотиды В растворе обнаруживается радиоактивность Следовательно, метка включилась в полимер нуклеиновой кислоты

Транскрипция РНК-полимераза Обрабатываем РНКазой Добавляем фракцию, обогащенную белком Удаляем нуклеотиды Радиоактивность в растворе не Транскрипция РНК-полимераза Обрабатываем РНКазой Добавляем фракцию, обогащенную белком Удаляем нуклеотиды Радиоактивность в растворе не обнаруживается Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Инкубируем Обрабатываем ДНКазой Удаляем нуклеотиды В растворе обнаруживается радиоактивность Следовательно, полученная молекула – полимерная РНК

Транскрипция РНК-полимераза Обрабатываем Добавляем фракцию, РНКазой обогащенную белком Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Удаляем нуклеотиды Транскрипция РНК-полимераза Обрабатываем Добавляем фракцию, РНКазой обогащенную белком Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды Удаляем нуклеотиды Инкубируем Обрабатываем ДНКазой В растворе обнаруживается радиоактивность Радиоактивность в растворе не обнаруживается Следовательно, для синтеза РНК нужна полимерная ДНК (а полимерная РНК не нужна)

Транскрипция РНК-полимераза ДНК-матрица (NМФ)n + NТФ (NМФ)n+1 + PPi ДНК-матрица Ф Ф Ф Ф Транскрипция РНК-полимераза ДНК-матрица (NМФ)n + NТФ (NМФ)n+1 + PPi ДНК-матрица Ф Ф Ф Ф Ф Ф А Г Т Ц Ц Т Г А Г Г Т А Ц А Т Т Ц Г Т А А Ц А У А А ФФФ Г Ц ФФФ Ф А Ф ФФФ Ф У Ф Ф Г ФФФ Г Ц А У Ф Ф Ф У Г Ф Ф Ф РНК Ф Ф

Транскрипция РНК-полимераза 1. РНК-полимераза требует наличия матрицы (ДНК). 2. РНК-полимераза присоединяет рибонуклеозидмонофосфат в соответствии Транскрипция РНК-полимераза 1. РНК-полимераза требует наличия матрицы (ДНК). 2. РНК-полимераза присоединяет рибонуклеозидмонофосфат в соответствии с правилом комплементарности относительно нуклеотида матрицы. 3. РНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК. 4. РНК-полимераза не требует наличия праймера. 5. РНК-полимераза присоединяет рибонуклеозидмонофосфат к 3’-ОН группе рибозы. 6. РНК-полимераза – белок с четвертичной структурой. 7. РНК-полимераза работает только на определенных участках ДНК.

Транскрипция РНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК 3’ 5’ 5’ 3’ Для работы РНК-полимеразы Транскрипция РНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК 3’ 5’ 5’ 3’ Для работы РНК-полимеразы требуется локальное плавление двухцепочечной ДНК (образование транскрипционного пузыря) 5’ 3’ 3’ 5’

Небольшое отступление Смысловая и антисмысловая цепи ДНК Генетический текст записан только в одной из Небольшое отступление Смысловая и антисмысловая цепи ДНК Генетический текст записан только в одной из двух цепей - смысловой 5’-АГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦ-3’ 3’-ТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГ-5’ Цепь, комплементарная (и антипараллельная) смысловой, - антисмысловая Генетический текст может быть записан в любой цепи ДНК, тогда смысловые и антисмысловые участки ДНК чередуются Смысловая цепь ДНК (ген А) Антимысловая цепь ДНК (ген Б) 5’-АГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦ-3’ 3’-ТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГ-5’ Смысловая цепь ДНК (ген Б) Антисмысловая цепь ДНК (ген А) Бессмысленный участок

Небольшое отступление Смысловая и антисмысловая цепи ДНК Генетический текст для разных генов может перекрываться Небольшое отступление Смысловая и антисмысловая цепи ДНК Генетический текст для разных генов может перекрываться Смысловая цепь ДНК (ген В) Смысловая цепь ДНК (ген А) Антимысловая цепь ДНК (ген Б) 5’-АГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦ-3’ 3’-ТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГ-5’ Антисмысловая цепь ДНК (ген А) Смысловая цепь ДНК (ген Б) Антисмысловая цепь ДНК (ген В) ген а ген в ген б

Транскрипция РНК-полимераза присоединяет рибонуклеотидмонофосфат к 3’-ОН группе рибозы Цепь РНК растет в направлении 5’-3’ Транскрипция РНК-полимераза присоединяет рибонуклеотидмонофосфат к 3’-ОН группе рибозы Цепь РНК растет в направлении 5’-3’ Матрицей служит цепь ДНК в направлении 3’-5’, т. е. АНТИСМЫСЛОВАЯ ЦЕПЬ ДНК Смысловая цепь ДНК 5’ 3’ 3’ Антимысловая цепь ДНК 5’ РНК (транскрипт) 3’ 5’

Транскрипция РНК-полимераза – белок с четвертичной структурой ω β’ 2 α, β, β’ – Транскрипция РНК-полимераза – белок с четвертичной структурой ω β’ 2 α, β, β’ – основной фермент αI αII σ ω – необходима для сборки фермента β σ – необходима для начала транскрипции Бактериальная РНК-полимераза состоит из 6 субъединиц – 2 α, β, β’, σ и ω молекулярный вес ~480 к. Да (1 Да = 1 а. е. м = 1/12 атома 12 С)

Транскрипция РНК-полимеразы Эукариоты Ядерные РНК-полимеразы РНК-полимераза бактерий РНК-полимераза I РНК-полимераза архей РНК-полимераза II РНК-полимераза Транскрипция РНК-полимеразы Эукариоты Ядерные РНК-полимеразы РНК-полимераза бактерий РНК-полимераза I РНК-полимераза архей РНК-полимераза II РНК-полимераза вирусов (У бактериофагов - 1 субъединица, нет четвертичной структуры) РНК-полимераза III РНК-полимераза IVa РНК-полимераза IVb Неядерные РНК-полимеразы РНК-полимераза митохондрий РНК-полимераза хлоропластов

Транскрипция РНК-полимераза работает только на определенных участках ДНК Точка начала транскрипции ДНК 5’-нетранскрибируемый участок Транскрипция РНК-полимераза работает только на определенных участках ДНК Точка начала транскрипции ДНК 5’-нетранскрибируемый участок ДНК Точка окончания транскрипции +1 Транскрибируемый участок ДНК Транскрипт (РНК) 3’-нетранскрибируемый участок ДНК

Транскрипция Этапы транскрипции 1. Инициация 2. Элонгация РНК 3. Терминация Транскрипция Этапы транскрипции 1. Инициация 2. Элонгация РНК 3. Терминация

Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий Промоторные cis-элементы бактерий Бокс Прибноу-Шаллера, 1975 (элемент -10) РНК-пол Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий Промоторные cis-элементы бактерий Бокс Прибноу-Шаллера, 1975 (элемент -10) РНК-пол Обработка ДНКазой РНК-пол Очистка ДНК -10 п. н. +1 Вероятность Т присутствия Г нуклеотида Ц А Консенсус = ТАТААТ

Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий Промоторные cis-элементы бактерий Бокс Гилберта, 1976 (элемент -35) -35 Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий Промоторные cis-элементы бактерий Бокс Гилберта, 1976 (элемент -35) -35 п. н. -10 п. н. +1 Т Г Ц А Консенсус = ТАГАЦА Вероятность присутствия нуклеотида

Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий 1. РНК-полимераза связывается с ДНК ω β’ αI αII Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий 1. РНК-полимераза связывается с ДНК ω β’ αI αII σ β 2. РНК-полимераза «ищет» промотор Элементы -35 и -10 определяют правильность посадки РНК полимеразы, т. е. точку начала и направление транскрипции 3. РНК-полимераза находит промотор, образуется закрытый транскрипционный комплекс

Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий 4. РНК-полимераза плавит ДНК между элементом -10 и точкой Транскрипция Инициация транскрипции у бактерий 4. РНК-полимераза плавит ДНК между элементом -10 и точкой начала транскрипции, образуется открытый транскрипционный комплекс 5. РНК-полимераза включает первый нуклеотид 6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Ядерные РНК-полимеразы РНК-полимераза III Рибосомная РНК 45 S р. Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Ядерные РНК-полимеразы РНК-полимераза III Рибосомная РНК 45 S р. РНК м. РНК т. РНК 5 S р. РНК 28 S р. РНК 18 S р. РНК 5. 8 S р. РНК Гены I класса Гены III класса

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот РНК-полимераза II С-концевой домен РНК-полимеразы II (CTD) от 25 Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот РНК-полимераза II С-концевой домен РНК-полимеразы II (CTD) от 25 до 52 повторов последовательности Тир-Сер-Про-Тре-Сер-Про-Сер тирозин серин треонин 6 8 1 11 3 4 10 12 7 2 5 9 РНК-полимераза II состоит из 12 субъединиц молекулярный вес ~550 к. Да

Ковалентные модификации белков Фосфорилирование Протеинкиназа (трансфераза) Ковалентные модификации белков Фосфорилирование Протеинкиназа (трансфераза)

Ковалентные модификации белков Ацетилирование Ацетилаза (трансфераза) Ковалентные модификации белков Ацетилирование Ацетилаза (трансфераза)

Ковалентные модификации белков Ацетилирование - + - Ковалентные модификации белков Ацетилирование - + -

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Общие факторы инициации транскрипции РНК-полимеразы II Для инициации транскрипции Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Общие факторы инициации транскрипции РНК-полимеразы II Для инициации транскрипции РНК-полимеразе требуются вспомогательные факторы Базальные факторы транскрицпии Гомология с σ-субъединицей бактериальной РНК-полимеразы TFIIA – 3 субъединицы TFIIB – 1 полипептид TFIID – до 17 субъединиц TFIIE – 4 субъединицы TFIIF – 2 субъединицы TFIIH – 10 субъединиц

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Промоторы генов II класса ТАТА-бокс (бокс Голдберга-Хогнеса, 1978) Инициатор Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Промоторы генов II класса ТАТА-бокс (бокс Голдберга-Хогнеса, 1978) Инициатор (Inr) +1 ~ -31 – -26 Т Г ТАТА АА А А -2 +4 Т YYAN YY А Y - пиримидин (Т или Ц) N - любой нуклеотид

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Связывание базальных факторов транскрипции с промотором Шаг 1. TFIID Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Связывание базальных факторов транскрипции с промотором Шаг 1. TFIID (TBP) связывается с ТАТА-боксом TFIID = TBP + белки TAF TBP-Associated Factor TBP TATA-box Binding Protein TAF 1 (TAFII 250) TAF 2 (TAFII 150) TAF 3 (TAFII 140) TAF 4 (TAFII 130/135) TAF 4 B (TAFII 105) TAF 5 (TAFII 100) TAF 6 (TAFII 70/80) TAF 7 (TAFII 55) TAF 8 (TAFII 43) TAF 9 (TAFII 31/32) TAF 9 B (TAFII 31 L) TAF 10 (TAFII 30) TAF 11 (TAFII 28) TAF 12 (TAFII 20/15) TAF 13 (TAFII 18) TAF 15 (TAFII 68) TBP связывается с малой бороздкой ДНК ТАТА-бокса и изгибает ДНК

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Связывание базальных факторов транскрипции с промотором TF IIB TF Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Связывание базальных факторов транскрипции с промотором TF IIB TF IIA Шаг 2. TFIIA и TFIIB связываются с TFIID (образуется комплекс DAB) Это связывание определяет точку начала и направление транскрипции TFIIA TFIID TATA TFIIB +1 Inr

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Связывание базальных факторов транскрипции и РНК-полимеразы с промотором Шаг Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Связывание базальных факторов транскрипции и РНК-полимеразы с промотором Шаг 3. С DAB связывается РНК-полимераза II в комплексе с TFIIF, TFIIE и TFIIH 6 8 11 3 1 4 7 10 12 TFIIH TFIIF 2 5 TFIIA TFIID TFIIB TATA 9 TFIIE TFIIF обеспечивает взаимодействие с TFIIB CTD РНК-полимеразы II связывается с DAB Образуется закрытый транскрипционный комплекс TFIIA TFIID TFIIB TATA TFIIH +1 TFIIF Inr TFIIE +1 Inr

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Начало транскрипции Шаг 4(а). TFIIH плавит ДНК, TFIIE стабилизирует Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Начало транскрипции Шаг 4(а). TFIIH плавит ДНК, TFIIE стабилизирует транскрипционный пузырь Образуется открытый транскрипционный комплекс Шаг 4(б). РНК-полимераза включает первый нуклеотид Шаг 4(в). TFIIH фосфорилирует CTD РНК-полимеразы II, РНК-полимераза утрачивает связь с DAB и начинает синтезировать РНК TFIIA TFIID TFIIB TATA Ф Ф TFIIH +1 TFIIF TFIIE

Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Начало транскрипции Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в Транскрипция Инициация транскрипции у эукариот Начало транскрипции Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в цепь РНК и останавливается TFIIA TFIID TFIIB Inr TATA Ф Ф +1 Ф Ф TFIIE TFIIF TFIIH

Транскрипция Элонгация транскрипции у бактерий 6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов 7. РНК удаляется, Транскрипция Элонгация транскрипции у бактерий 6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов 7. РНК удаляется, РНК-полимераза возвращается в точку начала транскрипции 7. Субъединица σ диссоциирует, РНК-полимераза продолжает синтезировать РНК

Транскрипция Элонгация транскрипции у бактерий «Собачка» храпового механизма «Мостик» храпового механизма αI αII Смысловая Транскрипция Элонгация транскрипции у бактерий «Собачка» храпового механизма «Мостик» храпового механизма αI αII Смысловая цепь ДНК β ДНК-связывающий сайт β’ Антисмысловая цепь ДНК РНК-связывающий сайт

Транскрипция Работа храпового механизма «Мостик» Антисмысловая нить ДНК РНК Смысловая нить «Собачка» Новый нуклеотид Транскрипция Работа храпового механизма «Мостик» Антисмысловая нить ДНК РНК Смысловая нить «Собачка» Новый нуклеотид

Транскрипция Элонгация транскрипции у эукариот Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в цепь РНК Транскрипция Элонгация транскрипции у эукариот Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в цепь РНК и останавливается TFIIA TFIID TFIIB +1 Inr TATA Ф Ф Шаг 6. С РНК-полимеразой связываются факторы элонгации (TFIIS и другие), которые снижают вероятность остановок РНК-полимеразы TFIIS TFIIA TFIID TATA TFIIB +1 Inr Ф Ф

Транскрипция Терминация транскрипции у бактерий Терминация без вспомогательных белков Терминирующий элемент 3’-NNNNNNNТАЦГГЦГТNNNNАЦГЦЦГТАААААNNNNNNN-5’ 5’-NNNNNNNАТГЦЦГЦАNNNNТГЦГГЦАТТТТТNNNNNNN-3’ N Транскрипция Терминация транскрипции у бактерий Терминация без вспомогательных белков Терминирующий элемент 3’-NNNNNNNТАЦГГЦГТNNNNАЦГЦЦГТАААААNNNNNNN-5’ 5’-NNNNNNNАТГЦЦГЦАNNNNТГЦГГЦАТТТТТNNNNNNN-3’ N – любой нуклеотид Палиндром 5’-NNNNNNNАУГЦЦГЦАNNNNУГЦГГЦАУУУУУ -3’ Образование шпильки замедляет транскрипцию Длинный тракт УУУУ образует слабую связь с матрицей AAAA. Это приводит к диссоциации комплекса РНК-полимеразы и транскрипта с матрицы ДНК

Транскрипция Терминация транскрипции у бактерий Терминация с участием вспомогательных белков Закодированный в ДНК Rho-связывающий Транскрипция Терминация транскрипции у бактерий Терминация с участием вспомогательных белков Закодированный в ДНК Rho-связывающий сайт транскрибируется Белок Rho связывается со своим сайтом Белок Rho «догоняет» РНК-полимеразу Белок Rho выталкивает молекулу РНК из транскрипционного пузыря, комплекс диссоциирует

Транскрипция Терминация транскрипции у эукариот Сигнал полиаденилирования Зона терминации транскрипции (терминатор) 500 -2000 н. Транскрипция Терминация транскрипции у эукариот Сигнал полиаденилирования Зона терминации транскрипции (терминатор) 500 -2000 н. Поли-А хвост

Транскрипция ДНК +1 Транскрипт (РНК) Транскрипция ДНК +1 Транскрипт (РНК)

Транскрибируемая и кодирующая ДНК Нетранскрибируемая ДНК Транскрибируемая ДНК Нетранскрибируемая ДНК Кодирующая ДНК Промотор Терминатор Транскрибируемая и кодирующая ДНК Нетранскрибируемая ДНК Транскрибируемая ДНК Нетранскрибируемая ДНК Кодирующая ДНК Промотор Терминатор Нетранслируемая РНК Транскрипт Трансляция Белок Нетранслируемая РНК

Экзон-интронная структура цистронов эукариот Цистрон прокариот Транскрибируемая ДНК Кодирующая ДНК Некодирующая ДНК Цистрон эукариот Экзон-интронная структура цистронов эукариот Цистрон прокариот Транскрибируемая ДНК Кодирующая ДНК Некодирующая ДНК Цистрон эукариот Транскрибируемая ДНК Кодирующая ДНК (совокупность экзонов) Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Некодирующая ДНК Интрон 3 Экзон 4

Экзон-интронная структура цистронов эукариот Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Экзон-интронная структура цистронов эукариот Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Интрон 3 Экзон 4 Транскрипция Транскрипт = Незрелая РНК Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Интрон 3 Созревание Экзон 1 Экзон 2 Экзон 3 Экзон 4

ПРОЦЕССИНГ м. РНК ПРОЦЕССИНГ м. РНК

Процессинг м. РНК Этапы процессинга 1. Кэпирование 2. Полиаденилирование 3. Сплайсинг Процессинг м. РНК Этапы процессинга 1. Кэпирование 2. Полиаденилирование 3. Сплайсинг

Процессинг м. РНК Кэпирование 5’ Незрелая м. РНК 3’ Процессинг м. РНК Кэпирование 5’ Незрелая м. РНК 3’

Процессинг м. РНК - кэприрование 1. Гидролиз одной 5’-концевой фосфатной группы Процессинг м. РНК - кэприрование 1. Гидролиз одной 5’-концевой фосфатной группы

Процессинг м. РНК - кэприрование 2. Присоединение ГТФ (минус пирофосфат) Процессинг м. РНК - кэприрование 2. Присоединение ГТФ (минус пирофосфат)

Процессинг м. РНК - кэприрование 3. Метилирование по 7 атому гуанина Кэп (m 7 Процессинг м. РНК - кэприрование 3. Метилирование по 7 атому гуанина Кэп (m 7 G)

Процессинг м. РНК - кэприрование 4. Метилирование нескольких нуклеотидов по 2’ атому рибозы Кэп Процессинг м. РНК - кэприрование 4. Метилирование нескольких нуклеотидов по 2’ атому рибозы Кэп (m 7 G)

Процессинг м. РНК - кэприрование Кэпирование происходит непосредственно в процессе транскрипции РНК-полимеразой II TFIIA Процессинг м. РНК - кэприрование Кэпирование происходит непосредственно в процессе транскрипции РНК-полимеразой II TFIIA CEC TFIID TFIIB +1 Inr TATA Ф Ф Capping Enzyme Complex Ф Ф CEC (Комплекс ферментов кэпирования) TFIIA TFIID TFIIB +1 Inr TATA Ф Ф CEC Кэп

Процессинг м. РНК - кэприрование Функции кэпа Транспорт из ядра в цитоплазму м. РНК Процессинг м. РНК - кэприрование Функции кэпа Транспорт из ядра в цитоплазму м. РНК кэпируется С кэпом связывается транспортирующий белок Защита от 5’-экзонуклеаз Некэпированная м. РНК быстро гидролизуется Кэпированная м. РНК устойчива к нуклеазам Транспортирующий белок переносит м. РНК в цитоплазму

Транскрипция Терминация транскрипции у эукариот Сигнал полиаденилирования Зона терминации транскрипции (терминатор) 500 -2000 н. Транскрипция Терминация транскрипции у эукариот Сигнал полиаденилирования Зона терминации транскрипции (терминатор) 500 -2000 н. Поли-А хвост

Процессинг м. РНК Полиаденилирование Сигнал полиаденилирования ААУААА Сайт разрезания ГУ-регион Процессинг м. РНК Полиаденилирование Сигнал полиаденилирования ААУААА Сайт разрезания ГУ-регион

Процессинг м. РНК - полиаденилирование Нуклеаза разрезает РНК у сайта полиаденилирования РНК-полимераза II ААУААА Процессинг м. РНК - полиаденилирование Нуклеаза разрезает РНК у сайта полиаденилирования РНК-полимераза II ААУААА ГУ-регион CPSF Cst. F Сайт разрезания CPSF – эндонуклеаза Cst. F – фактор узнавания ААУААА ГУ-регион CPSF Эндонуклеаза разрезает РНК Cst. F

Процессинг м. РНК - полиаденилирование Полиаденилатполимераза строит поли-А-хвост РНК-(А)n ААУААА PAP АТФ РНК-(А)n+1 PPi Процессинг м. РНК - полиаденилирование Полиаденилатполимераза строит поли-А-хвост РНК-(А)n ААУААА PAP АТФ РНК-(А)n+1 PPi (безматричный синтез РНК) CPSF PAP – полиаденилатполимераза ААУААА AAAAAAAAAA ~ 250 x. A PAP

Процессинг м. РНК - полиаденилирование Роль поли-А-хвоста Защита от 3’-экзонуклеаз – стабилизация РНК AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Процессинг м. РНК - полиаденилирование Роль поли-А-хвоста Защита от 3’-экзонуклеаз – стабилизация РНК AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Белок AAAAAAAAA Белок

Процессинг м. РНК Сплайсинг Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Процессинг м. РНК Сплайсинг Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Интрон 3 Экзон 4 Вырезание интронов Экзон 1 Экзон 2 Экзон 3 Экзон 4 Структура интрона Точка ветвления Экзон 1 ГУ 5’-сайт интрона А Экзон 2 АГ 3’-сайт интрона

Процессинг м. РНК - сплайсинг Переэтерификация точки ветвления и 5’-сайта интрона + + Экзон Процессинг м. РНК - сплайсинг Переэтерификация точки ветвления и 5’-сайта интрона + + Экзон 1 Экзон 2 ГУ А АГ 2’-OH группа рибозы Экзон 2 А Экзон 1 2’ «Лассо» О -О OH УГ АГ P 5’ О О

ГУ ГУ ГУ ГУ

ГУ А 2’-OH группа рибозы ГУ А 2’-OH группа рибозы

А 2’ «Лассо» О -О УГ P 5’ О О А 2’ «Лассо» О -О УГ P 5’ О О

Процессинг м. РНК - сплайсинг Вытеснение лассо Экзон 2 А АГ 2’ О -О Процессинг м. РНК - сплайсинг Вытеснение лассо Экзон 2 А АГ 2’ О -О УГ P 5’ О Экзон 1 О OH Экзон 1 Экзон 2 А АГ 2’ О -О УГ P 5’ О О

Процессинг м. РНК - сплайсинг Роль интронов и сплайсинга Защита кодирующей части гена от Процессинг м. РНК - сплайсинг Роль интронов и сплайсинга Защита кодирующей части гена от повреждений Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Интрон 3 Экзон 4 Кодирование одним геном нескольких белков Альтернативный сплайсинг Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3 Экзон 2 Экзон 3 e 1 e 2 e 3 Экзон 1 Экзон 2 e 1 e 2 Белок 2 Экзон 1 Экзон 3 e 1 e 3 Белок 3 Экзон 2 Экзон 3 e 2 e 3 Белок 4 Белок 1

Процессинг м. РНК Зрелая м. РНК Экзон 1 Кэп Интрон 1 Экзон 2 Интрон Процессинг м. РНК Зрелая м. РНК Экзон 1 Кэп Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзоны Экзон 3 Интрон 3 Экзон 4 Поли-А-хвост Трансляция

Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг Саузерн-блоттинг (1975) Электрофорез ДНК Вымачивание в щелочи для расхождения цепей Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг Саузерн-блоттинг (1975) Электрофорез ДНК Вымачивание в щелочи для расхождения цепей ДНК The Journal of the American Medical Association. -2005. -Vol. 294. -No. 11. -P. 1327 -1330 Эдвин Мэллор Саузерн (Edwin Mellor Southern) 1938 г. р. Гель, вид сбоку Перенос (блотинг) на фильтр Фильтр, вид сбоку

Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг Саузерн-блоттинг Интересующий нас фрагмент ДНК Фильтр, вид сбоку Денатурированная ДНК Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг Саузерн-блоттинг Интересующий нас фрагмент ДНК Фильтр, вид сбоку Денатурированная ДНК на фильтре + ДНК-полимераза I + Задача: определить, присутствует ли среди этих молекул ДНК участок, который нас интересует (например, какой-то ген) α-[32 P]-д. АТФ α-[32 P]-д. ГТФ α-[32 P]-д. ЦТФ α-[32 P]-д. ТТФ

Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг Саузерн-блоттинг Радиоактивно меченный фрагмент ДНК, интересующий нас Гибридизация с денатурированными Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг Саузерн-блоттинг Радиоактивно меченный фрагмент ДНК, интересующий нас Гибридизация с денатурированными образцами ДНК на фильтре Денатурация Фильтр Авторадиография на рентгеновской пленке

Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг «Southern» (Саузерн) – «южный» «Northern» (нозерн) – «северный» Перенос на Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг «Southern» (Саузерн) – «южный» «Northern» (нозерн) – «северный» Перенос на фильтр РНК «Western» (вестерн) – «западный» Перенос на фильтр белков (иммуноблотинг) «Eastern» (истерн) – «восточный» Перенос на фильтр белков после изоэлектрофокусирования

Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг 28 S р. РНК 18 S р. РНК Зона, где Транскрипция Методы изучения Нозерн-блоттинг 28 S р. РНК 18 S р. РНК Зона, где находится большинство м. РНК Блотинг Гибридизация с фрагментом ДНК, соответствующим интересующему нас гену Авторадиография Количество РНК, транскрибированной с интересующего нас гена, увеличилось

Транскрипция Обратная транскриптаза (ДНК-зависимая РНК-полимераза) РНК + праймер РНК + дезоксинуклеотиды РНК ДНК Транскрипция Обратная транскриптаза (ДНК-зависимая РНК-полимераза) РНК + праймер РНК + дезоксинуклеотиды РНК ДНК

Транскрипция Методы изучения ОТ-ПЦР Задача: определить наличие в клетках РНК, транскрибированной с определенного гена Транскрипция Методы изучения ОТ-ПЦР Задача: определить наличие в клетках РНК, транскрибированной с определенного гена Праймер Обратная транскриптаза 5’-ТТТТТТТТТТ-3’ (ОТ) Синтез ДНК Раствор РНК ПЦР

Транскрипция Методы изучения ОТ-ПЦР с праймерами, соответствующими интересующему нас гену ДНК 1 -й цикл Транскрипция Методы изучения ОТ-ПЦР с праймерами, соответствующими интересующему нас гену ДНК 1 -й цикл 2 -й цикл …. . Электрофорез Количество транскриптов интересующего нас гена уменьшается