Трансдукція у бактерій 1
Відкриття трансдукції. Дослід Н. Циндера та Дж. Ледерберга (1952 р. ) Аукосотрофні мутанти Salmonella typhimurium (S. enterica serovar Typhimurium) q Виникають прототрофні рекомбінанти, якщо А. Phe- Trp- Tyr- В. Met-His- батьківські штами поміщають у різні колінах Uподібної трубки, розділених бактерійним фільтром. Отже цей процес не потребує контакту клітин і відмінний від кон’югації q Рекомбінанти можна отримати і за допомогою безклітинного екстракту донора q Частота рекомбінантів ~ 10 -5 q Агент, що зумовлює перенесення генів, проходить через фільтр. На нього не діє ДНКаза. Отже агент, що зумовлює рекомбінацію, це не вільна ДНК і відкритий процес відмінний від генетичної трансформації Бактерійний q Це - бактеріофаг Р 22 фільтр q Один з батьківських штамів містив профаг Р 22 Генетична трансдукція – це перенесення невірусного генетичного матеріалу між клітинами за допомогою вірусів (у вірусній оболонці) q Обробка сироваткою проти Р 22 запобігає утворенню рекомбінантів q Фагостійкі мутанти S. typhimurium не адсорбують фага Р 22 і не утворюють рекомбінантів q. У 1955 році Е. Леннокс виявив, що помірний бактеріофаг P 1 здатний здійснювати трансдукцію 2 E. в coli
Схема досліду з трансдукції Інфікування бактеріофагом клітин бактерії-донора Pro+ Фаголізис клітин бактерії-донора Інфікування клітин реципієнта фаговим потомством, отриманим після лізису клітин донора Pro- Посів інфікованих клітин реципієнта на селективне середовище (СС) для відбору рекомбінантів (трансдуктантів) CC без проліну Відбір і аналіз трансдуктантів, які виникають унаслідок рекомбінації між фрагментом ДНК донора і хромосомою реципієнта Pro+ 3
А В Процеси, які спостерігали Н. Циндер і Дж. Ледерберг, а також Е. Ліннокс – це загальна трансдукція q Частинки бактеріофагів, що здійснюють трансдукцію формуються у донорній бактерії під час розвитку бактеріофагів q Залежно від природи молекул ДНК, які несуть ці частинки, їх ділять на два типи: 1. Частинки, що здійснюють загальну (неспецифічну, неспеціалізовану) трансдукцію § Вони несуть фрагмент ДНК бактерії-донора і не містять фагової ДНК 2. Частинки, що здійснюють специфічну (спеціалізовану) трансдукцію, § Вони несуть фагову і бактерійну ДНК як частини однієї молекули 4
Під час абортивної трансдукції фрагмент генома донора успадковується лише однією з дочірніх клітин A a A a a a 5
Неспецифічна (загальна) трансдукція. Фагові частинки переносять випадкові фрагменти генома донора. Вони утворюються як під час літичного розвитку фагів, так і після індукції профагів 1. 2. Донор 3. 4. A 5. A Реципієнт a 6. 7. × A a × Трансдуктант A 1 - інфікування фагом клітин – донорів генів; 2 – реплікація фагової хромосоми, руйнування хромосоми клітини; 3 – синтез та “збирання” фагових частинок, включення фагової ДНК у фагові головки, включення випадкових фрагментів хромосоми клітин - донорів в фагові головки; 4 – лізис клітин донорів; 5 – інфікування клітин – реципієнтів, ін’єкція ДНК донора; 6 - рекомбінація між ДНК донора та реципієнта; 7 - утворення гаплоїдних трансдуктантів 6
Бактеріофаг Р 1 § Помірний бактеріофаг E. coli. Має ікосаедричну головку, довгий хвостовий відросток (216 нм) з 6 боковими нитками. У вірусній частинці – двониткова лінійна ДНК § Після потрапляння у клітину ДНК фага замикається у кільце за рахунок рекомбінації між прямими повтореннями нуклеотидів на кінцях фагової хромосоми § У культурі лізогенних клітин геном фага Р 1 реплікується і успадковуються як плазміда 100 нм У головку бактеріофага Р 1 включається ~ 2 % хромосоми E. coli § Розмір геному Р 1 – 93 т. п. н. , розмір ДНК в головці фагових частинок – 110 т. п. н. з повтореннями нуклеотидних послідовностей на кінцях § Субстратом для пакування фагової ДНК у головки є конкатамерна молекула - результат реплікації ДНК фага під час його літичного розвитку за механізмом “rolling circle” § Розщеплення конкатемерної ДНК під час пакування у фагові головки відбувається за участю продуктів двох фагових генів – pac. A і рас. В. Розщеплення ДНК проходить у специфічних сайтах конкатамера – рас-сайтах. Якщо розмір генома прийняти за 100 %, то у фагову головку включається на ~ 10 % довша ДНК § Хромосома E. coli містить багато випадково розміщених псевдорас-сайтів, які за структурою нагадують рас-сайти хромосоми фага. Іноді (~ 1 раз на 1000) псевдо-рас-сайти використовуються для помилкового пакування хромосомної ДНК у головки фага. У результаті формуються частинки, які містять випадкові фрагменти 7 клітинної ДНК замість фагової ДНК
Формування фагових геномів з повтореннями нуклеотидних послідовностей на кінцях Конкатамер Розмір геному a b c d e f g h i-----x y z a b c d e f g h i- a’b’c’d’e’f’g’h’i’-----x’y’z’a’b’c’d’e’f’g’h’i’----x’y’z’a’b’c’d’e’f’g’h’i’- Розмір ділянки ДНК, що ”пакується” у фагову головку a b c a’b’c’ Молекули з надлишковими послідовностями на кінцях a’b’c’ d e f d’e’f’ g h i g’h’i’ 8
Бактеріофаг Р 22 § Помірний бактеріофаг S. typhimurium і E. coli. Належить до групи лямбдоїдних фагів за організацією генів у геномі подібний до бактеріофага лямбда. Можуть утворюватися гібриди Р 22 -λ § Має ікосаедричну головку (60 нм) і короткий хвостовий відросток. У вірусній частинці – двониткова лінійна ДНК з тупими кінцями § Після потрапляння у клітину ДНК фага замикається у кільце за рахунок рекомбінації між прямими повтореннями нуклеотидів на кінцях фагової хромосоми § У лізогенних клітинах геном фага Р 22 інтегрований в унікальний сайт хромосоми (ata. A у S. typhimurium, att. P 22 в E. coli в гені треоніл-т. РНК 2 thr. W) і успадковуються у її складі У головку бактеріофага Р 22 включається ~ 1 % хромосоми E. coli § Розмір геному Р 22 – 44 т. п. н. , розмір ДНК в головці фагових частинок – 48 т. п. н. з повтореннями нуклеотидних послідовностей на кінцях § Субстратом для пакування фагової ДНК у головки є конкатамерна молекула. Процес пакування ініціююється у рас-сайтах § За умов індукції можуть виникати фагові частинки, які здійснюють спеціалізовану трансдукцію і несуть гени, що знаходяться поруч з att-сайтом, a також частинки, що здійснюють загальну трансдукцію і несуть тільки клітинну ДНК 9
Лізат містить ~ 109 частинок Р 1 в 1 мл ~ 500 нормальних інфекційних частинок ~ 1 частика, яка несе хромосомну ДНК Лізат містить в 1 мл від 106 до 107 частинок, що несуть хромосомну ДНК і здатні здійснювати трансдукцію 4639 т. п. н. / 90 т. п. н ≈ 52 фагові частинки, потрібні щоб вмістити усю хромосому E. coli К 12 ! q В 1 мл лізату є достатньо частинок, здатних до трансдукції, у яких усі хромосомні послідовності E. coli представлені декілька разів 10
Природа фрагменту ДНК, який переноситься під час загальної трансдукції. Дослід Х. Ікеди та Д. Томізави Штами E. coli А Thy- B Thy- C Thy- Вирощування за присутності: Тиміну (T) 5 - бромурацилу (BU) Інфікування штамів фагом Р 1 Перенесення у момент інфікування бактерій з культури В на середовище з тиміном Включення в ДНК BU зумовлює збільшення густини ДНК і фагових частинок Отримання фаголізатів та їх центрифугування у градієнті Cs. Cl Відбір фракцій фагів, які займають різні положення в градієнті Cs. Cl Аналіз фагових частинок кожної фракції на наявність: Інфекційних частинок, здатних формувати негативні колонії Частинок, здатних до трансдукції реципієнтів Leu- у Leu+ - трансдуктанти 11
Частинки бактеріофагів, які здійснюють загальну трансдукцію, несуть тільки ДНК бактерій А - Інфекційні та трансдукуючі частинки бактеріофага Р 1, які утворилися на середовищі з тиміном мають однакову густину ~ 1, 47 г/см 3 (легкі, несуть ДНК з Т) В – Трансдукуючі частинки Р 1, які утворилися в культурі, де BU був у середовищі тільки до моменту інфікування, мають вищу густину (таку саму, як у випадку С, важкі). Інфекційні частинки мають нижчу густину (таку, як у випадку А, легкі) С - Інфекційні та трансдукуючі частинки бактеріофага Р 1, які утворилися на середовищі з бромурацилом мають однакову густину ~ 1, 49 г/см 3 (важкі, несуть ДНК з BU) q Інфекційні частинки з культури В містять фагову (легку) ДНК, яка синтезувалася під час їхнього розвитку в клітинах на середовищі з Т q Висока густина трансдукуючих фагових частинок, що утворилися в культурі В, свідчить про те, що вони несуть фрагменти хромосомної ДНК з BU, яка не реплікувалася після 12 інфікування донорних клітин фагом Р 1 і безпосередньо включилася у головки фагів
Доля ДНК, яка перенесена бактерій під час трансдукції в реципієнтній клітині Розщеплення нуклеазами Не >10 – 15 % Рекомбінація з гомологічною ДНК реципієнтної клітини ~1 – 2 % Перебування в цитоплазмі клітини у формі, яка не підлягає рекомбінації і розщепленню до 90 % q ДНК, внесена у клітину під час трансдукції відносно стійка до нуклеазної деградації q Білки Dar, які знаходяться в головці бактеріофага Р 1, захищають ДНК (і фагову, і хромосомну), яка пакується в головку від розщеплення рестрикційними ендонуклеазами реципієнтної клітини q Більшість рекомбінацій між трансдукованою і реципієнтною ДНК проходить протягом першої години після потрапляння ДНК q ДНК, яка не рекомбінувала протягом цього початкового періоду, дуже рідко 13 вступає у цей процес пізніше
Інтеграція хромосоми бактеріофага λ в хромосому E. coli є оборотним процесом R cos A N bio att. P × gal Int + IHF Xis +Int + IHF J att. L J Хромосома E. coli att. B 17’ Точне вирізання bio Хромосома фага λ A cos R Хромосома лізогенного штаму E. coli Інтеграція N gal att. R 14
Під час специфічної трансдукції переносяться лише певні гени донора. Утворення частинок бактеріофага λ, що здійснюють специфічну трансдукцію, відбувається після індукції профага bio A сos J R N att. L att. R Аномальне, рідкісне вирізання профага A J bio R gal N gal R N bio gal A Хромосома лізогенного штаму E. coli Індукція профага J R bio λbio J A R N gal λgal A Хромосоми трансдукуючих фагів q Дефектні фагові частинки, утворюються з частотою ~ 10 -6 та здійснюють специфічну трансдукцію q Такі лізати з малою часткою трансдукуючих частинок називають Lft-лізатими (від low-frequency transduction) 15
q У стабільних трансдуктантів ген gal реципієнта заміщений на алель gal+ Gal+ - трансдуктанти 1/3 стабільні Gal+ q Нестабільні трансдуктанти – часткові гетерозиготи gal/gal+, 2/3 нестабільні Gal+ Індукція Hft-лізат 10 -3 q Вони можуть утворювати похідні Gal-, які втратили ген gal+ донора Gal- - ідентичні реципієнту До 50 % фагів здатні до трансдукції gal+ 16
Трансдукція нелізогенних Gal- реципієнтних клітин λgal+ - фагом при низькій множинності інфікування 17
Трансдукція нелізогенних Gal- реципієнтних клітин λgal+ - фагом при високій множинності інфікування q При високій множинності зараження в клітину реципієнта потрапляють як хромосоми фагів дикого типу λ+, так і дефектні частинки λgal+ q При цьому можуть виникати подвійні лізогени за рахунок інтеграції λgal+ у вже інтегрований профаг λ+ Індукція Hft-лізат (від high-frequency transduction), в якому 50 % частинок мають здатність переносити ген gal+ q Завдяки функціонуванню геному λ+ забезпечуються усі продукти, необхідні для розмноження як λ+, так і дефектного λgal+ 18
Вірулентний бактеріофаг Помірний бактеріофаг Літичний розвиток Фагове потомство Нормальні фагові частинки Фагові частинки, що здійснюють загальну трансдукція 19
Помірний бактеріофаг Літичний розвиток Фагове потомство Фаговий геном, інтегрований в хромосому бактерії Лізогенізація Профаг Індукція профага Літичний розвиток Нормальні фагові частинки Фагові частинки, що здійснюють загальну трансдукція Фаговий геном, що підтримується і успадковується як плазміда Фагове потомство Нормальні фагові частинки Фагові частинки, що здійснюють спеціалізовану трансдукція Фагові частинки, що здійснюють загальну трансдукція 20
Принципи картування генів за допомогою трансдукції § Оскільки частота, з якою трансдукуючі частинки трапляються у лізатах, є дуже низькою, окрема реципієнтна клітина зазвичай інфікується тільки однією трансдукуючою частинкою § Імовірність одночасного інфікування однієї клітини двома трансдукуючими частинками є дуже низькою § Тому котрансдукція – успадкування більш ніж одного донорного маркера однією реципієнтною клітиною можливе лише тоді, коли вони зчеплені і переносяться при трансдукції в одному фрагменті ДНК § Вивчення частоти трансдукції генів – потужний метод картування генів на невеликих ділянках геному 21
1. Частота котрансдукції генів Спільна трансдукція (котрансдукція) зчеплених генів Незчеплені гени переносятся різними фаговими частинками 2. Частота рекомбінації між трансдукованими генами Кількість кросинговерів необхідних для утворення рекомбінантів 2 2 2 4 Висока імовірність успадкування рекомбінантами зчеплених генів Висока імовірність успадкування рекомбінантами одного з генів Низька імовірність успадкування 22 двох генів
Двофакторні схрещування дають змогу визначити зчеплення маркерів Донор met. B+ arg. H+ pur. D+ х Реципієнт met. B arg. H pur. D met+ - cелективний маркер Селекція met+ - трансдуктантів arg+ pur+ - неcелективні маркери Визначення частоти котрансдукції селективного маркера і неселективних маркерів Які з met+ - трансдуктантів є arg+ Які з met+ - трансдуктантів є pur+ met+ arg+ pur+ або met+ arg+ pur+ Якщо met+ arg+ pur або met+ arg pur будуть отримані, то маркери met. B і arg. H зчеплені, а met. B і pur. D – не зчеплені 23
Трифакторні схрещування дають змогу визначити порядок розміщення маркерів Донор А+В-С+ Реціпієнт А-В+С- Клас 1 А+В-С+ 100 Клас 2 А+В-С- 25 Клас 3 А+В+С+ 2 Клас 4 А+В+С- 25 Висока частота появи трансдуктантів класу 1 свідчить про те, що гени a, b, c зчеплені За умови, що гени a, b, c розміщені так: a+ b c+ a+ c+ b b a a b+ a c b+ c Для того, щоб отримати рекомбінанти класу 3 потрібні 4 кросинговери c b+ Для того, щоб отримати рекомбінанти класу 3 потрібні 2 кросинговери a + c+ Для того, щоб отримати рекомбінанти класу 3 потрібні 2 кросинговери Гени розміщені так: a – b – c 24
Донор rbs mut ilv+ Реціпієнт rbs+ mut+ ilv Донорний штам інфікували фагом Р 1 і фаголізатом обробили реципієнт і отримали ilv+ -трансдуктанти Класи ilv+ трансдуктантів: Клас 1 rbs+ mut 17 (15 %) Клас 2 rbs+mut+ 12 (10 %) Клас 3 rbs mut 67 (60 %) Клас 4 rbs mut+ 17 (15 %) Висока частота появи трансдуктантів класу 3 свідчить про те, що досліджені гени зчеплені За умови, що гени розміщені так: 1 2 3 4 r m i+ r+ m+ i Клас 1 - потребують кросинговерів в 2 і 4 Клас 2 – 3 і 4 Клас 4 – 1, 2, 3, 4 Ділянки, на яких проходять кросинговери m r i+ r m+ r+ i i+ m r + i m+ Клас 1 - 1, 2, 3 і 4 Клас 1 - 2 і 4 Клас 2 – 3 і 4 Клас 2 – 2 і 3 Клас 4 – 2 і 4 Клас 4 – 1 і 3 Гени розміщені так: rbs – mut – ilv 25
Скачать презентацию Трансдукція у бактерій 1 Відкриття трансдукції Дослід
MG_12.ppt