ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Тонкослойная хроматография ТСХ — вариант

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - вариант хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое (толщина 0, 1 -0, 5 мм) сорбента при их движении в потоке подвижной фазы (элюента).

ТСХ включает в себя физикохимические процессы, характерные как для адсорбционной, так и распределительной хроматографии.

Адсорбционная хроматография Основана на различии в адсорбционных свойствах компонентов разделяемой смеси. На поверхности твердого адсорбента имеются активные участки, свободное силовое поле которых способно фиксировать молекулы посторонних веществ. Во время хроматографирования происходит непрерывный процесс сорбции и десорбции растворенного вещества на поверхности растворителя. Когда число частиц, адсорбирующихся на поверхности равно числу частиц, покидающих ее, наступает равновесие. В состоянии равновесия каждой концентрации адсорбируемого вещества в подвижной фазе отвечает определенное количество его на адсорбенте.

n Изотерма адсорбции c Зависимость количества адсорбированного вещества от его концентрации от его равновесия выражается изотермой Ленгмюра.

Чем лучше адсорбируется вещество, тем меньше скорость продвижения по слою адсорбента. Поэтому отдельные компоненты смеси движутся через адсорбент с различной скоростью.

Распределительная хроматография Основана на различии в коэффициентах распределения компонентов разделяемой смеси между двумя несмешивающимися жидкостями, в которых компоненты растворяются, причем одна из жидкостей удерживается твердым носителем.

Растворитель продвигается через подвижную фазу и увлекает разделяемые вещества, находящиеся на носителе. Распределение происходит до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Константа равновесия зависит от природы растворителя и хроматографируемого вещества. Эту величину называют коэффициентом распределения Нернста: К=С 1/С 2, где С 1 и С – концентрация вещества в обеих фазах. Из-за различия в значении К индивидуальные вещества перемещаются с разной скоростью и благодаря этому достигается их разделение.

Область применения: Анализ смесей жидких или твердых веществ, различающихся по Rf. Анализ реакционных смесей, мониторинг протекания химических реакций. Мониторинг проведения колоночной хроматографиии, контроль чистоты отбираемых фракций. Определение чистоты конечного продукта.

Достоинства метода: это единственный хроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестной смеси простое и дешевое оборудование высокая селективность нет ограничений в выборе растворителей одновременное разделение нескольких образцов полученные результаты разделения легко оценить визуально экспрессность (продолжительность разделения 10 -100 мин)

Недостатки метода: ограниченная разделяющая способность из-за сравнительно небольшой длины разделяющей зоны (3 -10 см) чувствительность ниже, чем в случае ВЭЖХ зависимость результатов анализа от окружающей среды: относительной влажности, температуры, а также наличия загрязняющих веществ в воздухе трудности в работе с образцами, имеющими высокую летучесть, а также с веществами, чувствительными к действию кислорода, воздуха или света.

Этапы метода: 1)Нанесение анализируемой пробы на слой сорбента. 2) Разделение компонентов пробы на отдельные зоны в потоке подвижной фазы. 3) Обнаружение зон на слое сорбента (часто реагентом, образующим с разделенными веществами окрашенные соединения). 4) Количественная оценка полученного разделения, включая определение величины удерживания и определение содержания вещества в зонах на хроматограмме.

На слой сорбента наносят капли (объемом 1 -5 мкл) анализируемого раствора и погружают край пластинки в элюент, который находится на дне герметично закрываемой стеклянной камеры. Элюент продвигается по слою сорбента под действием капиллярных и гравитационных сил; анализируемая смесь перемещается в том же направлении. В результате многократного повторения актов сорбции и десорбции в соответствии с коэффициентом распределения в выбранной системе компоненты разделяются и располагаются на пластинке отдельными зонами.

Оборудование для ТСХ Камера для ТСХ

Капилляр Представляет собой стеклянную трубку с внутренним диаметром 0. 3 -1. 0 мм, вытянутую в пламени. Оба конца капилляра должны быть открыты. Края капилляра должны быть ровными, чтобы не царапать слой сорбента и при легком прикосновении переносить раствор вещества на пластинку. Чем уже капилляр, тем легче получить небольшое пятно вещества на пластине.

Камера для ТСХ Химический стакан с плоским дном, на дно которого наливается элюент слоем 4 -6 мм. Для воспроизводимых результатов дно и стенки емкости выкладываются фильтровальной бумагой, которая пропитывается элюентом. Емкость закрывается крышкой (или чашкой Петри, часовым стеклом) для избежания испарения элюента.

Элюент ØВыделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. ØЭлюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после проведения анализа. ØЭлюент подбирают таким образом, чтобы пятно целевого вещества выходило с Rf не более 0. 5 -0. 6 после одного прогона хроматограммы и было хорошо дифференцировано от примесей (~0. 1 Rf).

Количество элюента: Элюент наливается в емкость до образования слоя 4 -6 мм. Важно! Пластину погружают в элюент так, чтобы пятна веществ не соприкасались непосредственно с элюентом, иначе произойдет вымывание веществ в элюирующую смесь.

Сорбент Ø Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента. Ø Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот).

Примеры элюентов: Для неполярных неподвижных фаз: Вода Метанол 2 -Пропанол Тетрагидрофуран Ацетонитрил

Примеры элюентов: Для неполярных неподвижных фаз: Изопропиловый эфир Диэтиловый эфир 1 -Бутанол Этанол Метанол Тетрагидрофуран Пиридин Диметилформамид Ледяная уксусная кислота Этилацетат Ацетон Толуол Нитробензол Хлороформ Вода

Основные типы сорбентов, используемых в ТСХ: Силикагель – полярный адсорбент, содержит активные силанольные и силоксановые группы, его применяют для разделения соединений различной полярности. Оксид алюминия – полярный адсорбент с гетерогенной поверхностью, содержит активные ОН-группы, обладает заметно выраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют для разделения ароматических углеводородов, алкалоидов, хлоруглеводородов, стероидов. Флоросил – основной силикат магния, занимает промежуточное положение между оксидом алюминия и силикагелем; удобен для разделения флаваноидов, стероидов и ацетилированных углеводородов. Полиамиды – группа полярных сорбентов со смешанным механизмом разделения: карбоксамидная группа ответственна за адсорбционный механизм, метиленовые звенья – за распределительный механизм. Эти сорбенты применяют для разделения пищевых красителей, флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот. Модифицированные силикагели с привитыми группами (амино, циано, диол-, С 2 -, С 8 -, С 18 -), отличными по полярности.

Пластина Ø Ø Ø Ширина пластины определяется: по 5 мм от краев пластины, и 4 -6 мм расстояние между пятнами. Длина пластины: от 5 см (для хорошо разделяющихся веществ) до 10 см или более (для сложных смесей). Линия "старта" проводится карандашом на расстоянии 5 -7 мм от нижнего края пластины, с этого же края отрезаются уголки (~2 мм) для того, чтобы фронт элюента шел по пластине ровным слоем. Вещество наносится на пластину в виде раствора с достаточно небольшой концентрацией (иначе возможна "перегрузка пластины", т. е. вещества будут выходить длинной растянутой линией, не разделяясь) при помощи капилляра. Диаметр пятен 3 -5 мм. При мелких пятнах <2 мм вещество на пластине сильно концентрировано, в результате - плохое разделение. При больших пятная >6 мм - вещество сильно размывается при элюировании затрудняя дифференциацию пятен. Линия "финиша" проводится карандашом после окончания элюирования на расстоянии 3 -5 мм от верхнего края пластины. Важно! Для воспроизводимых результатов фронт элюента не должен достигать края пластины.

Полученная картина распределения хроматографических зон называется хроматограммой

Обнаружение пятен Большинство органических соединений не окрашены, т. о. не удается визуально определить положение пятен на пластине. Поэтому, после проведения ТСХ анализа требуется проявить пятна в ультрафиолетовом свете (УФ), йоде (I 2) или под действием специальных реагентов.

Положение хроматографических зон на хроматограмме характеризует величина Rfотношение пути li, пройденного центром зоны i-го компонента от линии старта, к пути l, пройденному элюентом: Rf = li/l; Rf 1. Величина Rf зависит от коэффициента распределения (адсорбции) и от соотношения объемов подвижной и неподвижной фаз.

Метод свидетелей: Самым надежным является метод свидетелей, когда на стартовую линию рядом с пробой наносятся индивидуальные вещества, соответствующие предполагаемым компонентам смеси. Влияние различных факторов на все вещества будут одинаковым, поэтому совпадение Rf компонента пробы и одного из свидетелей дает основание для отожествления веществ с учетом возможных наложений. На практике стандартное вещество (свидетель) в том же растворителе наносится на стартовую линию вместе с анализируемой пробой и хроматографируется в тех же условиях.

На разделение в ТСХ влияет ряд факторов: состав и свойства элюента, природа, дисперсность и пористость сорбента, температура, влажность, размеры и толщина слоя сорбента, размеры камеры. Поэтому для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательно стандартизовать условия опыта. Соблюдение этого требования позволяет устанавливать Rf с относительным стандартным отклонением 0, 03. В стандартных условиях Rf постоянна для данного вещества и используется для идентификации последнего.

Для количественной оценки содержания вещества в хроматографических зонах используют различные методы: 1. Определение с удалением хроматографической зоны с пластинки - можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента. 2. Определение соединений непосредственно на пластинке методом - визуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов. 3. Метод денситометрии - основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФ-свете с помощью денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и ее тушение.

4. Метод видеоденситометрии – сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм. Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. 5. Денситометрия с планшетным сканером сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра.