ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Рассматривается как принципиально новое направление

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Рассматривается как принципиально новое направление биологической науки, которое ставится в один ряд с - расщеплением атома - преодолением земного притяжения и - созданием средств электроники

Определение • Генная инженерия (синонимы: техника рекомбинантных ДНК, молекулярное клонирование) это совокупность приемов, позволяющих путем операций in vitro перенести генетический материал из одного организма – донора в другой – реципиент (хозяин) таким образом, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. • Перенос генов методами ГИ дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавть отдельные наследственные признаки одних организмов другим (напр. , от человека или животного - бактерии).

Предпосылки для создания технологии рекомбинантных ДНК • 1. открытие трансдукции • 2. открытие бактериальных плазмид • 3. открытие рестриктирующих эндонуклеаз

ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Требования к репликону • 1. должен быть доступен • 2. должен сохранять способность к воспроизведению и • 3. способность к внедрению в клетку при соединении с геном • 4. должен стабильно наследоваться • В распоряжении исследователя должны быть • • 1. способы соединения гена с вектором • 2. способы введения рекомбинантных репликонов в клетку -хозяина • 3. способы отбора клеток дикого типа от клеток, содержащих рекомбинантный репликон (трансформированные клетки)

Этапы в технологии рекомбинантных ДНК • 1. получение гена • 2. встраивание гена в вектор • 3. введение гена в составе вектора в клетку-реципиент (клетка-хозяин) • 4. скрининг (идентификация) и селекция (отбор) рекомбинантных клеток (клеток, которые приобрели желаемый ген)

Способы получения гена • 1. выделение из ДНК с помощью рестриктаз • Рестриктаза – эндонуклеаза, разрезающая ген в строго определенном месте, – сайте рестрикции. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, которые узнают 8590 различных нуклеотидных последовательностей (сайтов рестрикции) • 2. химико-ферментативный метод • 3. из м. РНК • 4. с помощью ПЦР

РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК РЕСТРИКТАЗАМИ

РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК_РЕСТРИКТАЗАМИ С ОБРАЗОВАНИЕМ «ЛИПКИХ» КОНЦОВ Bacillus amyloliquefaciens штамм H Bacillus cl o o Bacillus globiformis o o Escherichia coli штамм K 12 Haemophilus aegiptius Haemophilus influenzae штамм d

РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК_РЕСТРИКТАЗАМИ С ОБРАЗОВАНИЕМ «ТУПЫХ» КОНЦОВ

Недостатки метода выделения генов с помощью рестриктаз • 1. трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену; отсюда наряду с интересующим нас геном фрагменты ДНК включают лишние нуклеотидные последовательности, создающие помехи для использования гена • 2. рестриктаза может отщепить часть нуклеотидной последовательности гена, в результате чего ген теряет функциональную ценность • 3. при обработке ДНК рестриктазой образуется смесь фрагментов, выделить из которой нужный фрагмент – непростая задача • 4. эукариотические гены имеют незначащие последовательности – интроны, которые являются препятствием для нормального функционирования трансплантированных генов

Химико-ферментативный метод получения гена • Важнейшая альтернатива «вырезанию» генов из ДНК с помощью рестриктаз • Сущность: химический синтез олигонуклеотидов длиной 16 -20 нуклеотидов с последующей сшивкой их под действием лигазы. • Преимущества: • - позволяет точно воссоздать олигонуклеотидную последовательность гена • - обеспечивает возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регуляторных последовательностей • Недостатки: • - необходима полная информация о строении гена, поэтому применимость метода ограничена возможностями получения такой информации • P. S. Последовательность нуклеотидов в гене может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка

СШИВКА ФРАГМЕНТОВ ДНК-ЛИГАЗОЙ СШИВКА ФРАГМЕНТОВ ДНК ПО ЛИПКИМ КОНЦАМ

Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки м. РНК • Наиболее популярный метод синтеза генов • Сущность: • По механизму обратной транскрипции ревертаза (обратная транскриптаза) осуществляет синтез одноцепочечной к. ДНК (комплементарная ДНК). Затем ДНК-полимераза (или сама ревертаза) достраивает ее до 2 -х цепочечного состояния. • Преимущества: • - легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид м. РНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК • - получение полноценного гена

ПОЛУЧЕНИЕ ДНК ИЗ м. РНК

Получение гена с помощью ПЦР (полимеразно-цепной реакции) • Сущность: • химико-ферментативный синтез • Необходимое условие: • информация о строении фланкирующих (концевых) последовательностей гена

АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

ЛИНКЕРНАЯ ТЕХНИКА

КОННЕКТОРНАЯ ТЕХНИКА

Промежуточные итоги • Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. • Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена. • Поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется с помощью векторов.

Встраивание гена в вектор • Векторы – это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации, т. е. репликоны. • Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК. • Требования к вектору: • - вектор должен быть небольшим • - содержать уникальные участки расщепления рестриктазами (сайты рестрикции); причем только один для каждой из рестриктаз • - иметь, по крайней мере, два селективных маркера для оптимальной селекции рекомбинантных клеток

САЙТЫ РЕСТРИКЦИИ В ПЛАЗМИДЕ p. BR 322

ПРОЦЕДУРА ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

ЛИНЕЙНЫЙ БАКТЕРИОФАГ ЛЯМБДА Заштрихованы области необязательные для литической инфекции

ЧЕТЫРЕ ФОРМЫ БАКТЕРИОФАГА ЛЯМБДА

ТИПИЧНЫЙ ВЕКТОР, СОЗДАННЫЙ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГА ЛЯМБДА

Типичная космида на основе р. ВR 322

Молекулярное клонирование с помощью космидного вектора

ФАЗМИДА

ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР

Ёмкость вектора • 1. плазмида • 2. фаг λ • -вектор внедрения • - вектор замещения • 3. космиды • 4. фазмиды до 10 тыс. п. о. до 15 тыс. п. о. до 23 -24 тыс. п. о. 33 -49 тыс. п. о. до 23 тыс. п. о.

ТРАНСФОРМАЦИЯ. СКРИНИНГ И СЕЛЕКЦИЯ

Трансформация – процесс введения рекомбинантной ДНК в клетку, вызывающий в ней наследственные изменения Трансформация – наиболее универсальный путь передачи генетической информации, имеет наибольшее значение для генетической инженерии Как вариант трансформации можно рассматривать трансфекцию – процесс инфекции клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства.

Процедура отбора рекомбинантных клонов Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетки-хозяева в случае плазмид типа р. ВR 322 – из каждых 10000 -100000 плазмид в клетки попадает только одна Отделение трансформированных клеток от общей массы выполняется в процессе клонирования: 1. посев на твердую питательную среду (на 1 кв. см 5 -10 бактерий) 2. образование клонов в случае плазмидных векторов получают ровный мутный «газон» – позитивная колония в случае фаговых векторов на ровном мутном «газоне» прозрачные круглые просветы-бляшки (точки попадания бактерий с ДНК фага) – негативная колония 3. идентификация – отбор по определенному биологическому признаку - на селективных средах с антибиотиком, когда вектор – плазмида с помощью метода «реплик»

СКРИНИНГ(идентификация) РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛОНОВ С ПОМОЩЬЮ СТЕРИЛЬНЫХ БАРХАТНЫХ ФИЛЬТРОВ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛОНОВ Осуществляется по определенному биологическому признаку 1. либо по белковому продукту экспрессии рекомбинантной ДНК, 2. либо по самой рекомбинантной ДНК. Идентификация по белковому продукту экспрессии рекомбинантной ДНК 1. при наличии собственной биологической активности: - если экспрессии подвергается ген, кодирующий фермент, то рекомбинантные клоны идентифицируют по наличию в них соответствующей ферментативной активности - рекомбинантные клоны, синтезирующие интерферон, по противовирусной активности клеточных экстрактов 2. наиболее распространенный метод – м-д иммунохимического анализа.

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КЛОНОВ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛОНОВ по самой рекомбинантной ДНК 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. На основе методов гибридизации выращивание колоний на нитроцеллюлозных фильтрах приготовление реплик лизис клеток гибридизация с меченными ДНК- или РНК-зондами Получение зондов Химический синтез (когда известна структура «вставки» ) Выделение индивидуальных или сильно обогащенных м. РНК с последующим их иодированием (125) Ферментативный синтез соответствующей к. ДНК с использованием (32)Р-меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов

СКРИНИНГ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛОНОВ С ПОМОЩЬЮ НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ФИЛЬТРОВ. МЕТОД РАДИОАВТОГРАФИИ

ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ Условия экспрессии чужеродного гена в МО: 1. Наличие перед этим геном сильного промотора, распознаваемого РНКполимеразой клетки-хозяина сильные промоторы E. coli (те, с которых синтез РНК начинается часто): - лактозного оперона – lac UV 5 - триптофанового оперона –trp - гибридный промотор (trp-lac) – tac - промоторы фага λ - PR и PL Для практических целей удобнее регулируемая экспрессия. 2. Наличие перед геном чужеродного белка оптимального сайта инициации трансляции м. РНК. У бактерий он включает: • - последовательность SD из 3 -9 нуклеотидов • - инициирующий кодон AUG • - 3 -11 N между SD и AUG • - выраженную комплементарность к 3 -концу 16 S РНК

Три способа обеспечения эффективной трансляции чужеродной генетической информации 1. Сайт «внедрения» 2. «Гибридный сайт» связывания с рибосомами 3. «Гибридный оперон»

СПОСОБ 1 ПОЛУЧЕНИЕ ГОРМОНА СОМАТОСТАТИНА В КЛЕТКАХ Е. Coli

Требования к клеткам-хозяевам 1. использование мутантных клеток, дефектных по ферментам системы рестрикции-модификации - не должны содержать активную систему рестрикции, т. к. это угрожает целостности рекомбинантных ДНК, содержащих чувствительные сайты рестрикции - не должны содержать нормальные метилтрансферазы E. сoli, т. к. при репликации могут образовываться метилированные рекомбинантные ДНК, устойчивые к используемым в дальнейшем рестриктирующим эндонуклеазам 2. если вектором служит бактериофаг лямбда, то хозяйские клетки не должны быть лизогенными (препятствующими лизису), что связано с присутствием в них лямбда-репрессора – белка, блокирующего экспрессию генов лизиса 3. если вектор – плазмида, несущая маркерные гены, то хозяйские клетки не должны иметь похожего фенотипа (устойчивость к антибиотикам и токсинам, напр. солям тяжелых металлов, прототрофности)

Проблема стабильности м. РНК и белков в клетке-хозяине • Дополнительные функции, которыми должны обладать штаммыпродуценты для получения высокого выхода белка • 1. подавление нуклеолиза за счет введения мутаций, инактивирующих клеточные РНКазы • • • 2. для стабилизации чужеродных белков и пептидов можно - получать мутанты, дефектные пр протеолитическим ферментам - или вводить в реципиентные штаммы гены, контролирующие синтез ингибиторов протеиназ

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

Векторы для животных клеток Наиболее распространены векторы на основе следующих вирусов животных: 1. SV 40 – паповавирус, геном представлен ДНК размером 5243 п. о. Природные хозяева – макаки-резусы клетки-хозяева при культивировании – почки африканских зеленых мартышек (клеточные линии: Vero, CV-1). 2. Вирус полиомы – ДНК, 5295 п. о. клетки-хозяева – мыши, крысы получение интерферона человека 3. ВPV-1 вирус папилломы (бородавки) быка – «голый» вирус, 7945 п. о. внехромосомный вектор, т. е. не встраивается в хромосомы получение интерферона человека 4. Аденовирусы – «голый» вирус (без капсида) почти весь геном может быть замещен структурным геном клетки-хозяева: человек и др. позвоночные 5. HSV-вирус герпеса (есть капсид) клетки-хозяева: человек и др. позвоночные

Векторы для животных клеток (продолжение) 6. Ретровирусы – обеспечивают стабильную интеграцию гена в геном животной клетки 7. Бакуловирусы – вирусы насекомых; не опасны для животных NPV – вирус калифорнийской совки - имеет очень сильный промотор - в цитоплазме накапливается до 25% суммарного белка 8. Транспозоны эукариот

Краткая характеристика вируса SV 40 – сферический вирус, содержащий 2 -х цепочечную кольцевую ДНК, в которой установлены участки, кодирующие пять вирусных белков: - малый Т-антиген - большой Т-антиген - VP 1 – главный белок капсида - VP 2 и VP 3 белки представлены в меньших количествах При попадании в клетку SV 40 направляется к ядру. Первыми транскрибируются гены малого и большого Т-антигенов. Новые вирусные частицы появляются приблизительно через 30 ч, через 4 суток все клетки разрушаются. Тот же инфекционный процесс может быть инициирован в результате трансфекции с помощью очищенной ДНК вируса.

Векторы на основе SV 40 Различают 3 типа векторов 1. Трансдуцирующие SV 40 -векторы - реплицируются - упаковываются в вирионы 2. Плазмидные SV 40 -векторы - реплицируются 3. Пассивные трансформирующие SV 40 -векторы - необходимо присутствие вирусов-помощников, синтезирующих продукты недостающих генов

Трансформация животных клеток 1. Кальций-фосфатный метод ДНК образует комплекс с микрокристаллами фосфата кальция, кот. проникают в клетку за счет фагоцитоза 2. Использование ДЕАЕ-декстрана Дает комплекс с ДНК, что предохраняет ее от действия клеточных рестриктаз 3. Физические методы - электропорация 5 -10 кв/см; 2 -4 тыс. вольт 70 -80 трансформантов на 1 млн. клеток (1 мг ДНК)

Трансформация животных клеток (окончание) - метод микроинъекций - с помощью иглы: трансформируется 25% клеток, по наследству признак передается у 2% трансформантов - с помощью микропипетки (0. 1 -0. 5 микрона): трансформируется 50% клеток; выживаемость меньше Преимущества: - в принципе любую ДНК можно ввести в любые клетки - не требуется никакого селективного давления для сохранения в клетке введенного гена Недостатки: - дорогостоящее оборудование - длительная практика для овладения методом 4. Липосомы – задействуется механизм эндоцитоза 5. Слияние сферопластов с клетками в присутствии ПЭГ путем прямого переноса плазмид (челночных) из бактерий в клетки 6. Вирусный метод – действие вирусов и вирусоподобных частиц (используют оболочки вируса Сендай, полиомы)

Физические методы При использовании физических методов для доставки генов требуется сложное и дорогое оборудование, дают низкую эффективность трансфекции и имеют ограниченную область применения, но в некоторых случаях незаменимы.

Фенотипический отбор трансформированных клеток (селекция) Существуют 2 основных подхода: 1. Применение мутантных клеток-хозяев (tk-)

Фенотипический отбор на селективной среде НАТ в случае мутантных клеток-хозяев

Фенотипический отбор трансформированных клеток 2. Применение нормальных клеток-хозяев. Пример 1. Доминантный ген E. coli gpt

Фенотипический отбор на селективной среде в случае нормальных клеток-хозяев

Фенотипический отбор на селективной среде в случае нормальных клеток-хозяев Пример 2. Доминантный ген E. coli neo • Ген E. coli neo кодирует аминогликозидфосфотрансферазу • Отбор трансформантов проводится на селективной среде, содержащей антибиотик G-418 (аналог неомицина и канамицина). На этой среде выживают только рекомбинантные клоны, дикий тип погибает. • Доминантными селективными маркерами могут также служить бактериальный ген резистентности к гигромицину (hph) и ген млекопитающих, кодирующий устойчивую к метатрексату (метаболический антибиотик) форму дигидрофолатредуктазы.

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ

Способы получения трансгенных животных • 1. Введение экзогенной ДНК в организм взрослых животных. • - по технологии еx vivо • - создание условий для селективного роста трансформированных клеток (трансформирующий ген дополняется геноммаркером , придающим устойчивость к метатрексатуметаболическому антибиотику, который используется для селекции). Ген dhfr (дигидрофолатредуктаза)- ген-маркер, придающий устойчивость к метатрексату (МТх+). • 2. Трансформация стволовых клеток – • - по технологии еx vivо • - инъекции в эмбрионы мыши

Способы получения трансгенных животных (продолжение) • 3. Трансформация ооцитов животных • - по технологии еx vivо (микроинъекции) • - помещается в матку; все клетки полученного трансгенного животного содержат введенный ген, который передается по наследству. • 4. Трансформация эмбриона - получение «мозаичных мышей» • - по технологии еx vivо (проводят с помощью вектора SV 40) • - возвращается в матку

Принцип получения клона млекопитающих, использованный в опытах Яна Вильмута. Цитоплазма яицеклетки и клетки донора окрашены в разные цвета