ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ

• ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ДНК Профессор каф. Зоологии факультета биологии РГПУ им. А. И. Герцена д. б. н. Цымбаленко Н. В.

• В настоящее время существует два подхода для получения необходимого количества конкретного участка исследуемой ДНК: • 1. Клонирование ДНК in vivo в клетках прокариот или эукариот (клонирование – получение клона, т. е. совокупности идетничных клеток). • 2. Амплификация ДНК in vitro методом полимеразной цепной реакции.

Для клонирования ДНК in vivo нужно: • ДНК-вставка (ДНК-мишень, ДНКинтереса); • ДНК-вектор (генетический вектор клонирования); • клетка-хозяин; • набор ферментов-инструментов и вспомогательных олигонуклеотидов

Вставки ДНК: • геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью физических методов, например, с помощью обработки ультразвуком, либо с помощью эндонуклеаз рестрикции; • синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или ферментативным методоми, либо при комбинировании этих методов; • фрагменты ДНК (к. ДНК), полученные с помощь обратной транскрипции in vitro.

• Общая схема выделения геномной. ДНК

В основе молекулярного клонирования лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна включать в себя новые последовательности ДНК, обеспечивать их перенос в системы, где созданная in vitro ДНК будет воспроизводиться in vivo, давая начало новому клону клеток, отличному фенотипически от исходных клеток хозяина (реципиента).

• Вектор для переноса генетической информации должен удовлетворять ряду основных требований: • 1. Способность к автономной репликации, т. е. обладание ori (точка инициации репликации). • 2. Небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в E. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н. • 3. Наличие уникального сайта рестрикции для какой-либо РЭ. • 4. Наличие селективного маркера, позволяющего вести отбор рекомбинантных ДНК. • 5. Обеспечение достаточной копийности рекомбинантной ДНК в используемой биологической системе.

• ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ • Плазмиды – внехромосомные автономнореплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. • Плазмидные векторы создают на основе природных плазмид (F-плазмиды, R-плазмиды, плазмиды деградации, криптические плазмиды) методами генной инженерии с использованием ферментов-инструментов. • Высококопийные плазмиды представлены 10 -1000 копиями ДНК на клетку. Низкокопийные присутствуют в клетке в числе 1 -4 копий.

Вектор клонирования p. BR 322 был создан Боливаром и Родригесом в 80 -тые годы прошлого века – один из самых популярных универсальных векторов для клонирования ДНК. • Гены устойчивости к тетрациклину( ) и ампициллину ( ) содержат уникальные сайты узнавания для Hind. III, Sal. I, Bam. HI и Pst. I. Сайты Eco. RI и Pvu. II расположены вне этих генов. Длина вектора — 4361 п. н.

• Фенотипические свойства клеток, содержащих плазмиду p. BR 322 со вставками и без них

• • Трансформация – процесс введения рекомбинантной ДНК в бактериальную клетку. • Клетка-хозяин должна иметь определенный фенотип: • r , т. е. в ней не должно быть рестриктаз; • она должна быть неспособна к общей рекомбинации (rec. A ), чтобы экзогенная ДНК не модифицировалась в результате гомологичной рекомбинации.

• • Частота трансформации – доля клеток в клеточной популяции, получивших чужеродную ДНК; выражается числом трансформантов к общему числу клеток. • Эффективность трансформации - число трансформантов в расчете на 1 мкг ДНК, взятой для трансформации. • Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. • 1. Трансформация E. coli с помощью обработки хлоридом кальция • 2. Электропорация – увеличение проницаемости клеток под воздействием импульса тока длительностью ~4, 5 мс. • 3. Введение чужеродной ДНК в составе искусственных бактериальных хромосом (BAC). •

• Селективный отбор на основании присутствия –отсутствия резистентности к определенному антибиотику • •

• • Эпоха вектора p. BR 322, начатая Боливаром и Родригесом в самом начале 80 -тых годов ХХ-го столетия, продолжается и по сей день. • Однако, при всей своей надежности и классическом соответствии всем необходимым для векторов требованиям, этот вектор имеет всего несколько удобных сайтов для клонирования. Кроме того, отбор трансформированных клеток в экспериментах с рекомбинантными ДНК на его основе занимает много времени.

• • • Группа векторов семейства p. UC • “unicom cloning” – обозначает наличие в структуре ДНК полилинкера, который представляет собой последовательность нуклеотидов, составленную из сайтов узнавания ряда эндонуклеаз рестрикции, уникальных для данного вектора. • Названия индивидуальных векторов из семейства p. UC отличаются двузначным числом, а первичная структура разных векторов отличается составом сайтов MCS – Multiple Cloning Sites в полилинкере.

• Плазмидный вектор p. UC 19 содержит: -ген устойчивости к ампициллину (Amp); -регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lac. Z) лактозного оперона E. coli; -ген lac. I, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lac. Z; -полилинкер – короткую последовательность с множеством уникальных сайтов для РЭ; -точку начала репликации плазмиды p. BR 322.

• ИПТГ (изопропил-β-D-тиогалактопиранозид) – индуктор lac – оперона. В его присутствии продукт гена lac. I не сможет связаться с промоторнооператорной областью гена lac. Z , и как следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена lac. Z. Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК (α-комплементация) , и в результате образуется активная β-галактозидаза. Субстрат последней 5 -бром-4 -хлор-3 -индолил- β-Dгалактопиранозил (Х-gal) гидролизуется с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную плазмиду p. UC 19. Встраивание вставки ДНК в область полилинкера нарушает целостность последовательности гена lac. Z в плазмиде, тем самым блокируя синтез активной β-галактозидазы, которая способна расщеплять Х-gal. В результате колонии не окрашиваются в голубой цвет.

•

• • • ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ КРУПНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы: 1. На основе ДНК фагов, в частности, на основе ДНК бактериофага λ E. coli. 2. Космиды. 3. Искусственные бактериальные хромосомы (BAC).

• • Векторы на основе бактериофага λ. Два альтернативных пути развития событий при проникновении фага λ в клетки E. coli. : 1. Литический цикл – фаг начинает активно размножаться и примерно через 20 минут клетка разрушается с высвобождением до 100 новых фаговых частиц 2. Состояние лизогении – фаговая ДНК включается в хромосому E. coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными клетками. Однако при неблагоприятных условиях (нехватка питания) запускается литический цикл

• • • Литический путь развития фага λ 1. При репликации кольцевой ДНК бактериофага λ образуется линейная молекула, состоящая из повторяющихся сегментов длиной примерно 50 т. п. н. Каждый из этих сегментов представляет собой полноразмерную фаговую ДНК, фланкированную липкими cos-сайтами. 2. Фаговая головка вмещает один такой сегмент, затем к головке присоединяется уже собранный отросток. Смешав in vitro в пробирке пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.

Литический путь развития бактериофага λ

• • Рекомбинантные молекулы упаковывают в головки бактериофага λ in vitro, и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы.

• • • Приготовление экстрактов для осуществления упаковки in vitro ДНК фага λ. Используют два штамма E. coli, каждый из которых лизогенен в отношении определенного мутантного штамма фага λ. 1. Штамм, клетки которого не способны синтезировать белок А (один из полипептидов терминазы). 2. Штамм, клетки которого не синтезируют белок Е (белок головки). Оба этих белка необходимы для упаковки ДНК фага λ. А и Е - экстракты смешивают и добавляют конкатемерную ДНК фага, которая связывается с терминазой прежде. чем происходит разрезание в cos-сайтах, и упаковывается в фаговые головки

• Упаковка in vitro ДНК фага λ

• • Процесс введения рекомбинантной фаговой ДНК со встроенным фрагментом чужеродной генетической информации в клетки-реципиенты основан на естественном природном явлении – трансдукции фаговой ДНК. Трансдукция (лат. transduction перемещение) представляет собой процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Таким образом, трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе фаговой ДНК не требует специальной подготовки клеток-реципиентов или какого-либо специального приборного оснащения

• Космиды – один из видов гибридных векторов, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, и обладают способностью упаковываться in vitro в оболочки частиц фага λ. Такие векторы могут включать до 40 т. п. н. чужеродной ДНК.

• Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК (вставки >100 т. п. н. ) имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р 1 –искусственная хромосома на основе фага Р 1. На основе F -плазмиды E. coli создана BAC (bacterial artificial chromosomes).

– – Клонирование фрагментов ДНК большого размера с помощью ВАС

• ВАС - стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 350 т. п. н. • Трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе ВАС проводится методом электропорации •

• • • СЛОВАРЬ Клон, клонирование ДНК, картирование сайтов рестрикции, ДНК-вставка, генетический вектор, плазмида, сайт клонирования, селективный маркер, селекция клонов, лигирование, трансформация, эффективность трансформации, частота трансформации, компетентные клетки, электропорация, полилинкер, MСS, cos-сайт, трансдукция, космида, ВАС – вектор.

• Клонирование фрагментов ДНК в клетках E. coli

• Встраивание фрагментов ДНК в вектор по липким и тупым концам.

Встраивание в вектор синтетического полилинкера с адапторными концами •

Клонирование фрагмента ДНК в векторе p. BR 322

Скриннинг клонированных последовательностей ДНК с помощью ДНК-ДНК гибридизации

Клонирование фрагмента мт. ДНК крысы в векторе p. BR 322 • 1. Выделение мт. ДНК крысы. 2. Рестрикционный анализ мт. ДНК. 3. Построение физической карты мт. ДНК крысы. 4. Выбор фрагмента ДНК для клонирования. 5. Получение линеаризованной ДНК p. BR 322 и фрагмента мт. В-А. 6. Проведение лигирования линеаризованного вектора и фрагмента мт. ДНК. 7. Получение компетентных клеток E. coli НВ 101 при обработке клеток раствором хлорида кальция. 8. Трансформация клеток E. coli продуктами лигирования. 9. Анализ и отбор трансформантов. 10. Выделение и рестрикционный анализ ДНК рекомбинантных плазмид p. BR-mt. B-A. 11. Гибидизационный анализ полученных клонов с меченными зондами на основе мт. ДНК крысы.

• Клонирование фрагмента мт. ДНК крысы в векторе p. BR 322 Построение физической карты мт. ДНК крысы

Электрофореграмма фрагментов мт. ДНК крысы, рекомбинантной ДНК p. BRmt. B-A и ДНК плазмиды p. BR 322, получаемых при гидролизе рестрикционой эндонуклеазой Bam. HI • 1 – p. BR 322 (4, 2 т. п. н. ) • 2 – p. BRmt. B-A (10, 6 и 4, 2 т. п. н. ) • 3 – мт. ДНК (10, 6 и 4, 8 т. п. н. )

• Физическая карта рекомбинантной ДНК p. BR-мt. В-А по участкам узнавания эндонуклеаз рестрикции с установленной ориентацией встраивания фрагмента мт. ДНК в вектор. BR 322

• Гибридизация колоний клеток E. coli pol. A, трансформированных ДНК p. BR 322 (1, 3) и ДНК p. BRмt. В-А (2, 4) с -мт. ДНК. 1, 2 - нитроцеллюлозные фильтры после лизиса клеток, фиксации ДНК и окрашивания 0, 25%-ным метиленовым синим; 3, 4 - радиоавтографы фильтров после экспозиции 48 часов .

Задача • Рестриктазы Bam. HI и Pst. I разрезают узнаваемые ими последовательности на двухцепочечной ДНК:

А. Укажите где находятся 5’- и 3’- концы разрезаемых молекул ДНК Б. Как будут модифицироваться эти концы, если инкубировать разрезанные молекулы ДНК с ДНКполимеразой в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов? В. Могут ли концы, появляющиеся в результате разрезания ферментом Bam. HI, соединиться вновь при инкубации с ДНК-лигазой после того, как была проведена реакция, о которой шла речь в пункте Б? Г. Можно ли соединить вместе концы ДНК, образовавшиеся при обработке Pst. I? Д. Будет ли регенерировать узнаваемый Bam. HI сайт, о котором шла речь в пункте В, при соединении концов? Будет ли регенерировать сайт, узнаваемый Pst. I?