ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ Профессор

• ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ Профессор каф. Зоологии факультета биологии РГПУ им. А. И. Герцена д. б. н. Цымбаленко Н. В.

• СОЗДАНИЕ ГЕНОМНЫХ БИБЛИОТЕК • Идентификация генов, кодирующих определенные белки (структурные гены) – цель очень многих биотехнологических экспериментов. • Создание геномной библиотеки (банка клонов, банка генов)- процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введение этих элементов в клетки-хозяева. • Полная библиотека по определению содержит весь геном данного организма. • Специфика структурной организации генов прокариот и эукариот инициирует разработку и применение различной стратегии для их клонирования.

Прокариоты • У прокариот искомая последовательность (ДНКмишень) часто составляет минимальную часть (0, 02%) суммарной хромосомной ДНК. Алгоритм: • суммарную ДНК гидролизуют РЭ и каждый из полученных фрагментов встраивают в вектор • проводят поиск специфической клеточной линии (клона), которая содержит нужную последовательность • выделяют ДНК и анализируют

• Частичный гидролиз фрагмента ДНК рестриктазой типа II • Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, узнающей тетрануклеотиды, например, Sau 3 AI, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты различных размеров. • Глубину гидролиза обычно контролируют изменением времени инкубации или количества фермента. Одни молекулы, представленные на рисунке, расщеплены по всем сайтам для рестриктазы (REI-сайтам), другие только по некоторым

• Частичный гидролиз фрагмента ДНК рестриктазой типа II •

• Схема создания геномной библиотеки с помощью вектора на основе ДНК λ-фага

• Следующий после создания библиотеки этап – это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода: • гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующей визуализацией отобранных образцов (изотопная и неизотопная) • иммунологический скрининг • скрининг по активности белка, кодируемого геноммишенью

• Скрининг с помощью гибридизации (рис. 1)

• Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. • Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр), так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке. • Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. • На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. • Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят детекцию, чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. • Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

• Скрининг с помощью гибридизации (рис. 2) • Процесс образования водородных связей между комплементарными полинуклеотидными цепями, в результате которого образуются гибриды ДНК-ДНК • либо ДНК-РНК, называется гибридизацией

• Получение меченых ДНК-зондов • Меченые зонды можно получить разными способами: • методом концевого мечения с помощью полинуклеотидкиназы, осуществляющей присоединение изотопа фосфора в ﻻ положении. • методом ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы I • методом случайных праймеров, который основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов. • Радиоактивное мечение – один из d. NTP содержит в α-положении изотоп фосфора (32 или 33). Радиоактивную метку выявляют с помощью радиоавтографии. • В качестве нерадиоактивной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех d. NTP.

•

• Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить, по крайней мере, двумя способами: • Использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд); • Зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.

• • Иммунологический скрининг Если клонированный ген экспрессируется, то его продукт – весь белок или часть – можно обнаружить иммунологическими методами.

• 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку. • 2. Клетки подвергают лизису, белки фиксируют на фильтре. • 3. Наносят на фильтр первые АТ, которые связываются только с искомым белком. • 4. Несвязавшиеся первые АТ удаляют, наносят на фильтр вторые АТ, специфичные в отношении первых, связанные с ферментом (например, щелочной фосфатазой). • 5. Отмывают фильтр от несвязавшихся вторых АТ и наносят на фильтр бесцветный субстрат для фермента, при гидролизе которого образуется окрашенный продукт. Гидролиз может произойти только в присутствии вторых антител. • 6. Отбирают колонии на чашке, соответствующие окрашенным пятнам на фильтре, и культивируют их. В них может содержаться рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, гомологичный первым АТ

• Клонирование структурных генов эукариот • Проблемы клонирования эукариотических генов в системе прокариот: • 1. Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-транскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических м. РНК в бактериальной клетке невозможна. • 2. Экспрессия эукариотической ДНК может осуществляться только при наличии прокариотических сигнальных последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию.

Схема основных этапов экспрессии генов в клетках прокариот (А) и эукариот (Б)

• Этапы клонирования генов эукариот 1. Выделение м. РНК на колонках, заполненных олиго(d. T)-целлюлозой или олиго(d. T)-сефарозой. 2. Синтез одноцепочечной к. ДНК на матрице м. РНК с помощью ревертазы, праймера олиго(d. T) и четырех d. NTP. 3. Синтез двухцепочечной к. ДНК. 4. После завершения синтеза молекулы м. РНК гидролизуют РНК-азой Н, а ДНК обрабатывают нуклеазой SI, в результате чего получаются линейные молекулы ДНК с тупыми концами без шпилек. 5. к. ДНК встраивают в плазмидный вектор и получают к. ДНК-библиотеку. Для скрининга к. ДНК-библиотеки можно использовать метод гибридизации или иммунологические методы.