Тест открытое поле М Г Плескачева Лаб физиологии

Тест «открытое поле» М. Г. Плескачева Лаб. физиологии и генетики поведения, кафедра ВНД Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова 2013

Автор теста «открытое поле» Hall C. S. Emotional behavior in the rat. I. , Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality. J. Comp. Psychol. , 1934, 18, 385 -403 III. The relationship between emotionality and ambulatory activity. J. Comp. Psychol. , 1936, 22, 345 -452 Calvin S. Hall (USA) 1909 -1985

Открытое поле К. Холла – хорошо освещенная круглая арена диаметром 1. 2 м, стенкой 45 см, пол которой размечен радиальными и круговыми линиями. Крысу выпускали от борта, в течение 2 мин регистрировали подвижность по числу пересеченных секторов арены, а также уровень дефекации и уринации Тест заключается в количественном измерении компонентов поведения животного, помещенного в новое открытое пространство (арену), выбраться из которого ему мешает огораживающая арену стенка

Наблюдение Холла: страх, который испытывают животные при помещении их в новую потенциально опасную среду, сопровождается высоким уровнем дефекации «Эмоциональные» крысы – высокий уровень дефекации и низкая подвижность «Неэмоциональные» крысы – низкий уровень дефекации и высокая подвижность

Подтверждения правильности использования параметров Холла для оценки эмоциональности 1. Негативная корреляция показателей дефекации и горизонтальной двигательной активности 2. Дефекация усиливается при усилении аверсивности среды (яркий свет, сильный шум и др. ) 3. У крыс, генетически отобранных по уровню дефекации в ОП, высокие показатели эмоциональности выявляются и в других экспериментальных ситуациях. И , наоборот, у животных селектированных по показателям, связанным с повышенной эмоциональностью в других тестах, наблюдают аналогичный уровень эмоциональности в ОП

Критика валидности показателей эмоциональности по Холлу (J. Archer и др. ) 1. Привыкание (повторное тестирование) часто приводит к снижению и уровня дефекации, и горизонтальной двигательной активности 2. Некоторые линии различаются по двигательной активности, но имеют сходные характеристики по дефекации 3. Животные могут проявлять активность, пытаясь убежать из арены 4. В ряде экспериментов усиление аверсивности среды не изменяло двигательную активность 5. Некоторые фармакологические препараты могут усиливать подвижность, но это усиление не связано со снижением уровня тревожности 6. Низкий уровень дефекации у самок

Дополнительные показатели поведения в ОП 1. Горизонтальная активность в центре и периферии арены. Тигмотаксис у грызунов 2. Вертикальная активность (стойки на задних лапах, rearing) с опорой и без опоры на борт арены 3. Заглядываний в норки в полу арены 4. Реакция замирания (freezing, длительность, число эпизодов) 5. Груминг (grooming, длительность, число эпизодов) 6. Уринация

О слабой тревожности грызунов могут свидетельствовать: высокая (особенно в первые минуты) горизонтальная и вертикальная активность частое посещение и стойки в центральной части арены заглядывание в норки низкая дефекация и уринация редкие эпизоды груминга ? ? ? Показатели высокой тревожности: частые и длительные эпизоды замирания, низкая подвижность и редкие стойки избегание центральной части арены высокий уровень дефекации длительный груминг ? ? ?

• Новизна среды активирует сложный набор интегрированных поведенческих реакций, отражающих тревожность и стремление исследовать новую территорию • Баланс оборонительных и исследовательских тенденций определяет текущее поведение животного в ОП, изменяющееся по времени тестирования

Использование видеотрекинга для оценки поведенческих показателей в ОП (Etho. Vision, Easy. Track, Any-maze и др). 1. Автоматическая регистрация длины пути 2. Возможность оценки подвижности в разных зонах арены 3. Ввод с клавиатуры поведенческих показателей. 4. Визуализация трека, вычисление многочисленных показателей, характеризующих передвижение животных (скорость, извилистость пути, остановки, предпочтения поворотов в какуюлибо сторону и др. ) 5. Повышение объективности регистрации поведения

Факторы, влияющие на показатели в открытом поле 1. Условия тестирования: освещенность, уровень шума, размеры и цвет арены… 2. Условия выращивания и содержания 3. Генетические особенности животных 4. Видоспецифические особенности реагирования на новую среду 5. Влияние пола и возраста, зависимость эффекта от линии животных 6. 6. Повторность тестирования изменяет показатели животных. Проявляется угашение ранее высокой активности или усиление подвижности при снижении уровня тревожности

Характер исследования пространства у мышей C 57 BL/6 зависел от размера арены (35, 75, 150 и 220 см в диаметре) Стойки без опоры Стойки с опорой При слабом освещении длина пути и количество стоек у мышей увеличивается с увеличением размера арены. Прирост активности не был пропорционален изменению размера арены. Уровень дефекации не отличался Лебедев и др. , 2012, ЖВНД

Характер исследования пространства у полевки Microtus socialis зависел от размера арены Eilam, 2003 В условиях яркого освещения не было значимых различий по длине пути.

Показатели мышей разных линий (Mouse Clinical Institute, Страсбург) Мыши линии C 57 BL/6 активны в открытом поле

Характер передвижения в пространстве мышей разных линий различен Арена диаметром 250 см N. Kafkafi, G. I. Elmer, 2005

Индивидуальные различия. Длина пути (см) Рыжие полевки, группа 1 3 -мин интервал

Индивидуальные различия. Длина пути (см) Рыжие полевки, группа 2 3 -мин интервал

Индивидуальные различия. Длина пути (см) Рыжие полевки, группа 3 3 -мин интервал

длина пути (м) Усредненный показатель горизонтальной активности полевок не отражает реальных особенностей изменения активности в ходе опыта минуты

Визуализация трека мыши с использованием программы Etho. Vision XT 7 Скорость

Визуализация трека мыши с использованием программы Etho. Vision XT 7 Стойки

Недостатки методики «Открытое поле» • Не стандартизирована • Высокая индивидуальная вариабельность поведенческих показателей • Трудности интерпретации полученных показателей

Перспективы. Детальный анализ структуры трека, разделение трека на фрагменты ( «сегменты» ). • Трек разбивают на «сегменты» , границы которых определяют по эпизодам минимальной скорости или ускорения (остановкам). • Сегменты можно сортировать по скоростным характеристикам и идентифицировать текущее поведение. Segment Analyzer • Сегменты можно объединять в «экскурсии» от места выпуска (или других, предпочитаемых животными мест – «домашних баз» -home bases, где они часто останавливаются)

Основы сегментного анализа треков • Анализ характеристик сегментов (средние значения длины, длительности, максимальной скорости). • Анализ частот распределения сегментов с разными характеристиками • Анализ пространственного распределения активности.

Изучение исследовательской активности методами сегментного анализа треков SEE (Software for the Exploration of Exploration)- Golani, Eilam, Kafkafi et al. – разработана на основе этологически ориентированных экспериментов при изучении исследовательской активности грызунов разных видов в незнакомой среде Segment. Analyzer (Мухина, Анохин). Программа, используемая Wallace, Whishaw et al.

Выделение сегментов (программа SEE Software for the Exploration of Exploration) Высокоскоростной сегмент Низкоскоростной сегмент Kafkafi et al. , 2005

Программная сортировка сегментов (SEE) Исходный трек. 30 мин. min max Мышь C 57 BL/6 3 сорта сегментов, различающихся по характеристикам сегментов (расстояние от стенки)

Траектории передвижения мышей C 57 BL/6 в аренах разного размера Диаметр: 35 см 75 см 150 см 220 см Размер арены влияет на характер и скорость передвижения и скорости сегментов пути (голубым и красным цветом отмечены высокоскоростные сегменты). Увеличение размера приводит не только к увеличению скорости, но и к изменению структуры трека и его расположения в пространстве арены). Segment Analyzer ( © Т. V. Mukhina, К. V. Аnоkhin) Лебедев и др. 2012

Распределение сегментов траектории с разными характеристиками максимальной скорости и длины у мышей C 57 BL/6 Характеристики сегментов отличаются в аренах разного размера. С увеличением площади арен увеличивается максимальная скорость сегментов и их длина. Удаление темпоральной части гиппокампа приводит к увеличению доли скоростных протяженных сегментов, особенно в больших аренах Lebedev et al. , 2012 FENS

Распределение сегментов траектории с разными характеристиками максимальной скорости и длины у рыжих полевок Характеристики сегментов рыжих полевок отличаются от характеристик мышей большей максимальной скоростью Lebedev et al. , 2012 FENS

Использование сегментного анализа для выявления слабых дефектов поведения Анализ характеристик сегмента возврата крысы в стартовый бокс выявляет нарушения при удалении гиппокампа (в темноте) и при удалении энторинальной коры (на свету) Отклонение от цели hpc ec Winter, Koppen, Ebert, Wallace, 2013

Организация передвижения рыжей полевки по арене с предметами 3 предмета Через сутки, 2 предмета start Программа Segment. Analyzer ( © Т. V. Mukhina, К. V. Аnоkhin) позволяет выделять разными цветами функционально различные сегменты пути start

• Передвижение животных в пространстве не хаотично, а структурировано • Структура маршрута определяется видоспецифическими и линейными особенностями поведения, зависит от пола, возраста, индивидуального опыта животного и характера исследуемого пространства • Исследовательская активность (exploration) – начальная фаза построения пространственного представления (Eilam, 2008)

Для получения более полного представления о поведении животных в экспериментальном пространстве автоматизированный анализ треков (длина пути, усредненная скорость, время и количество заходов в зоны и т. д. ) должен дополняться детальной информацией об организации передвижения, скоростными и пространственными характеристиками его структурных компонентов

Основные тенденции развития технологий поведенческого фенотипирования • Стандартизация, детализация протоколов тестирования • Расширение батарей тестов • Использование новых технических возможностей (мощных компьютеров, видеокамер с высоким разрешением, специализированного программного обеспечения) для регистрации и анализа поведения. • Разработка новых критериев оценки поведенческих показателей и характера их изменений при экспериментальных воздействиях.

Тесты для оценки тревожности (anxiety, anxiety-like) • Открытое поле • Приподнятый крестообразный лабиринт • Черно-белая камера • Гипофагия в новых условиях Основаны на естественном поведении грызунов, оценка оборонительных, исследовательских и пищедобывающих реакций в незнакомой среде

Приподнятый крестообразный лабиринт (Elevated plus-maze = cross-maze)

Приподнятый крестообразный лабиринт (Elevated plus-maze = cross-maze) Прообраз лабиринта: Y-образный лабиринт с открытым рукавом Montgomery K. C. (1958) Авторы: Handley S. L. , Mithani S. (1984). Время тестирования: 5 мин Регистрируемые показатели: Латентный период захода в открытый рукав Время пребывания в закрытых и открытых рукавах Число заходов в открытые и закрытые рукава Количество стоек, свешиваний с рукава, дефекаций

Приподнятый крестообразный лабиринт (Elevated plus-maze = cross-maze) Ограничения метода: Падения и спрыгивание животных с рукавов Замирание в открытых рукавах Слишком высокий или слишком низкий уровень активности

Light-Dark box test 20 сm Авторы: J. N. Crawley, F. K. Goodwin, 1980 Время регистрации: 5 -10 мин

Light-Dark box test Регистрируемые показатели: 1. Латентный период захода в темный отсек 2. 2. Время пребывания в отсеках 3. 3. Число перебежек из отсека в отсек 4. 4. Исследовательская активность 5. 5. Дефекация 6. Ограничения метода: 7. Повышенная общая активность животных может привести неверной трактовке результатов 8. У животных, склонных к замиранию, может наблюдаться снижение активности на старте и увеличение латентного периода захода в темный отсек

Индуцированная новизной гипофагия (hyponeophagia) Потребление нового корма в новой среде. Время регистрации 2 -5 мин Показатели: Латентный период взятия в лапы корма Количество съеденного корма R. M. J. Deacon, J. N. P. Rawlins, 2005

Hyponeophagia Тест с использованием разбавленного сгущенного молока

Приподнятый крестообразный лабиринт, открытое поле, черно-белая камера оценивают тревожность на основе показателей подвижности животных. Тесты, основанные на неофагии позволяют этого избежать, что позволяет снизить ошибки при интерпретации данных об уровне тревожности животных.

Комбинации тестов дают более надежную оценку поведения Гипонеофагия Line et al. , 2011

2009

http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/books/NBK 5217/ Kathleen Bailey, Jacqueline Crowley 2009 Anxiety-Related Behaviors in Mice

Спасибо за внимание!

Регистрация в темноте контроль удален гиппокамп Wallace, Whishaw, 2003

Анализ «экскурсии» у крыс по арене диаметром 250 см старт Скорость м/с контроль Удален гиппокамп 1, 2, 3, 4 – сегменты пути от старта Время, с Пунктирная линия – обратный путь к точке старта Wallace, Whishaw, 2003

Распределение низкоскоростных сегментов по арене диаметром 6. 5 м. у крысы (программа SEE).

• Передвижение животных в пространстве не хаотично, а структурировано • Структура маршрута определяется видоспецифическими и линейными особенностями поведения, зависит от пола, возраста, индивидуального опыта животного и характера исследуемого пространства