Теоретические основы молекулярной и клеточной радиобиологии
Вопросы. • 1. Количественные теории в радиобиологии. • Качественные теории в радиобиологии.
Введение • В развития теоретических представлений в радиобиологии отмечены 2 основных направления: ü количественное – стремится объяснить все многообразие лучевых реакций; ü качественное – стремится установить общие феноменологические закономерности, характеризующие начальные звенья лучевого поражения.
1. Количественные теории в радиобиологии. • 1. Принцип попадания и мишени. • 2. Стохастическая теория. • 3. Вероятностная модель поражения клетки.
Принцип попадания и мишени. • Сформировался в 20 -30 -х гг. 20 века под влиянием бурно развивающийся ядерной физики, молекулярной биологии и генетики, а также представлений о прямом и непрямом действии радиации. • Автор – Н. В. Тимофеев-Ресовский.
Основной радиобиологический парадокс – предпосылка к возникновению принципа попадания и мишени • несоответствие между ничтожным количеством поглощенной клеткой энергии ИИ и вызываемым большим биологическим эффектом.
Основные положения • 1. В основе изменений, вызываемых ИИ в биологических объектах, лежат два основных механизма: ü прямое действие – молекула испытывает изменения непосредственно от ИИ, а поражающее действие связано с актом возбуждения и ионизации атомов и макромолекул; ü непрямое (косвенное) действие – молекула получает энергию для изменения посредством продуктов радиолиза воды или растворенных веществ.
Основные положения • 2. Первичный этап действия ИИ на организм представляет собой цепь последовательных стадий: физическая, физико-химическая, химическая и биологическая.
Последовательность процессов, ведущих к радиационному поражению. Стадия 1. Физическая. Явления в живых организмах Начальные взаимодействия энергии Время 10 -24 – 10 -14 с ионизирующего излучения с атомами биологических молекул – возбуждение атомов. 2. Физико- Перераспределение химическая. ионизации. 3. Химическая. Образование энергии свободных за счет радикалов, которые могут окислять биологические молекулы. 10 -12 – 10 -8 с 10 -7 с – несколько часов
Последовательность процессов, ведущих к радиационному поражению (продолжение). 4. Биологическая. Повреждение белков, нуклеиновых 10 -3 с – кислот несколько и других биологических молекул, приводящее к нарушению их функций. 5. Ранние Гибель клеток, биологические органов, всего часов организма. часы - недели эффекты. 6. Отдаленные Возникновение опухолей, годы биологические генетические нарушения, сокращение столетия эффекты. продолжительности жизни. -
История развития принципа • 1. Гипотеза «точечного тепла» Ф. Дессауэра – большой биологический эффект при действии ИИ объясняется тем, что энергия концентрируется в малых объемах, приводя к микролокальному разогреву. Т. к. распределение ее случайное, то эффект будет зависеть от попадания определенного числа дискретных порций энергии в жизненно важные микрообъемы внутри клетки - мишени.
Недостатки теории Дессауэра. • 1. Доказана только для первичных физических «пусковых» механизмов. • 2. Не учитывала физико-химической стадии и образования активных радикалов.
История развития принципа • 2. Работы Блау и Альтенбургера (1922 г. ) – путем математических расчетов вывели общую формулу для кривых «доза – эффект» , в которую входило число попаданий в определенный «чувствительный объем» , необходимое для одной единицы реакции, например, для гибели клетки.
История развития принципа • 3. Работы Дж. Кроузера, Д. Ли, К. Г. Циммермана, Н. В. Тимофеева-Ресовского и др. – дан количественный анализ, основанный на принципе попадания: ü ИИ переносят энергию в дискретном виде; ü акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению; ü эффект наступает, если число попаданий в мишень равно по крайней мере n.
Количественный анализ был основан на следующих данных: • При воздействии ИИ на биологические объекты не всякая энергия такого излучения приводит к биологическому эффекту. • Живая клетка и ее органеллы гетерогенны в отношении чувствительности к облучению. • Радиационный эффект в клетке возникает по принципу «все или ничего» в зависимости от попадания или непопадания ИИ в уникальную структуру.
Принцип мишеней в современной интерпретации • объем живых клеток гетерогенен по своей радиочувствительности: в нем имеются определенные участки (мишени), попадание в которые и только в них приводит к поражению.
Выводы из принципа попаданий: • 1. Радиационный эффект обусловлен одним или несколькими попаданиями ИИ в клетку, поэтому в зависимости от вида объекта и характера ИИ различают мишени одно-, двуударные и т. д. • 2. Экспоненциальные кривые «доза-эффект» указывают на то, что одного попадания в чувствительный объем клетки достаточно для проявления радиационного эффекта (для макромолекул в растворе, бактериальных спор, некоторых одноклеточных).
Выводы из принципа попаданий: • 3. На основании принципа можно анализировать кривые «доза-эффект» , полученные в эксперименте, - от простых экспоненциальных до сигмоидальных с различной величиной «плеча» . Однако наиболее строго он применим к одноударным мишеням, для которых можно с его помощью рассчитать их размеры и число. • Инактивация многих ферментов и вирусов – одноударная реакция, а размер чувствительного объема близок к размеру молекулы.
Мнение Н. В. Тимофеева-Ресовского: • Принцип попадания не является теорией; это общее установление дискретной природы физических взаимодействий ИИ с веществом. Принцип мишеней в радиобиологии отображает гетерогенность живого вещества. Т. е. принципы попаданий и мишеней характеризуют основу первичных процессов, ведущих к возникновению радиационнохимических и радиобиологических реакций в облученных клетках
Недостатки принципа попаданий и мишеней. • 1. Затруднена интерпретация многоударных кривых. • 2. Применение принципа наиболее эффективно в случае объяснения эффектов во внутриклеточных структурах (мутации, хромосомные аберрации, гены и т. п. ) с применением различных типов ИИ и режимов воздействия. • 3. Не подлежат объяснению с позиций принципа процессы взаимодействия продуктов радиолиза воды с различными органеллами клетки.
Стохастическая теория. • В случае массивных повреждений эффект детерминирован уже на начальной стадии. Но каждому лабильному состоянию объекта соответствует определенная вероятность наступления реакции, возрастающая с увеличением предварительного повреждения. • Т. е. при формировании радиобиологического эффекта всегда существует суперпозиция множества случайных событий – стохастическое рассмотрение эффекта радиационного поражения.
Основные подходы стохастической теории • Любой биологический объект – лабильная динамическая система, которая постоянно находится в стадии перехода из одного состояния в другое, которое связано с множеством сопряженных реакций. • В процессе жизнедеятельности под влиянием не подлежащих учету факторов, возникает вероятность «отказов» в элементарных звеньях, а вследствие этого – «крушение» всей системы. Поэтому любое критическое событие (митоз или гибель клетки) можно предсказать с известной вероятностью.
Стохастическая теория рассматривает: • Различные возмущения биологической системы (в процессе жизнедеятельности или под влиянием ИИ) с позиций теории вероятности. • Мишени – все компоненты живой системы, а регистрируемая реакция обусловлена суперпозицией самых разных событий.
Положительные стороны стохастической теории • 1. Учитывает как физиологические, так и индуцированные ИИ процессы в их динамике (принцип попаданий – строго детерминированные первичными актами абсорбции энергии). Т. о. выводы теории мишеней являются частным случаем стохастического подхода.
Положительные стороны стохастической теории • 2. Стохастическая концепция предлагает более «биологическую» интерпретацию кривых выживания, хотя основным остается предположение о случайной природе абсорбции энергии. • 3. Для обозначения клеточных повреждений вводится понятие «дисперсного начального повреждения» при различной природе таких повреждений (изменение мембран, инактивация системы и т. д. )
Положительные стороны стохастической теории • 4. Понятие «компенсационной способности объекта» репаративные процессы сказываются на конечном эффекте. Этим объясняется наличие «плеча» на кривой выживания и ее сигмоидный характер. Экстраполяционное число – это количественное выражение компенсационной способности объекта, а не число мишеней.
Общие свойства теории мишеней и стохастической теории • 1. Строго количественный подход. При этом стохастическая теория – это логическое дополнение теории мишеней. • 2. Упрощенные представления о механизме первичных радиобиологических процессов на основе физических и радиационнохимических представлений, установленных при облучении простых систем.
Общие свойства теории мишеней и стохастической теории • 3. Дискретность радиационного агента и функциональная негомогенность биологического. Однако в системе новых представлений развита идея определяющей роли стохастической природы физиологических процессов и их радиационных нарушений.
Вывод • Стохастическая теория учитывает современные данные о микрораспределении энергии, вариабельности радиочувствительности и роль репарационных процессов. • Она более «биологична» , т. к. устанавливает связь с конкретными морфологическими и функциональными особенностями объектов. • Однако ее математический аппарат достаточно сложен и затрудняет ее применение.
Вероятностная модель радиационного поражения клетки. • Ю. Г. Капульцевич (1978 г. ) – дополнил принцип попаданий предположением о вероятностном характере проявления повреждений, основываясь на анализе количественных закономерностей различных реакций дрожжевых клеток на облучение.
Вероятностная модель радиационного поражения клетки. • 1. Разные клетки, подвергнутые облучению в одной и той же дозе, поражаются в разной степени в соответствии с принципом попаданий, но в отличие от классических представлений, и потенциальные, и реализованные повреждения проявляются с вероятностью меньше единицы.
Вероятностная модель радиационного поражения клетки. • 2. Реализованные повреждения (или индуцированные ими изменения) наследуются при делении клеток и с некоторой вероятностью, зависящей от числа этих повреждений, приводят к неосуществлению этого деления. • 3. Вероятность проявления повреждений может зависеть как от биологических особенностей клеток, так и от условий культивирования.
Вывод: • Формально вероятностная модель является как бы синтезом принципа попаданий и стохастической концепции: ü использует основные положения первого; ü дополняет последнюю, расширяя диапазон явлений, которые могут быть интерпретированы с позиций биологической стохастичности.
Главные отличия вероятностной модели от классических теорий: • 1. Позволяет предсказать многообразие биологических эффектов на основе минимума исходных предположений, описывая качественно и количественно (системой уравнений) различные проявления нарушения репродуктивной способности клеток. • 2. С позиций классических теорий радиочувствительность определяется лишь объемом мишени и критическим числом попаданий, а вероятностная модель процесс радиационного поражения клетки делит на три этапа.
Этапы радиационного поражения клетки • 1. Осуществление событий попаданий, в результате которых формируются первичные потенциальные повреждения. Вероятность образования первичного повреждения на единицу дозы излучения зависит от величины эффективного объема и от величины энергии, необходимой для образования первичного повреждения. Эти параметры зависят от особенностей биологического объекта и условий облучения (температуры, влажности, концентрации О 2).
Этапы радиационного поражения клетки • 2. Реализация потенциальных повреждений – т. к. клетки способны восстанавливаться от лучевых повреждений, то реализованными оказываются лишь некоторые потенциальные повреждения, поэтому радиочувствительность определяется также вероятностью реализации потенциальных повреждений. При этом вероятностная модель учитывает зависимость радиобиологических эффектов от дозы излучения, ЛПЭ и продолжительности восстановления.
Этапы радиационного поражения клетки • 3. Различные вторичные нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, вызываемые реализацией повреждений. Вероятность проявления реализованного повреждения не равна единице, так как и на этом этапе возможно восстановление клеток от последствий реализованных повреждений или их компенсация. При этом вероятностная модель позволяет проанализировать пострадиационные модификации эффектов, не связанные с восстановлением.
Недостатки вероятностной модели • 1. Не позволяет выявить природу повреждений, лежащих в основе этих реакций. • 2. Сделанные выводы справедливы для дрожжевых клеток. • 3. Не указаны конкретные биохимические процессы, определяющие биологическое действие радиации.
2. Качественные теории в радиобиологии. • Радиобиологический парадокс с позиций качественных гипотез объясняется наличием различных биологических механизмов усиления первичных повреждений. • Основными биохимическими продуктами, инициирующими множественные повреждения различных клеточных органелл, являются радиотоксины.
Гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций. • Начало этой гипотезе дали работы А. С. Мочалиной, Ю. Б. Кудряшова (50 -е годы 20 века) по изучению свойств водно-солевых вытяжек из облученной печени (вызывают гемолиз). Была установлена липидная природа образующегося в печени и не только (в крови, тонком кишечнике, семенниках, почках, желудке и др. органах) - цитотоксического агента – липидный радиотоксин (ЛРТ).
Характеристика ЛРТ. • 1. Лабильный комплекс продуктов окисления ненасыщенных ЖК, гидропероксидов, эпоксидов, альдегидов и кетонов. • 2. Кроме гемолиза вызывает другие реакции лучевого поражения – торможение клеточного деления, нарушение кроветворения, повреждение хромосомного аппарата некоторых объектов и т. д.
В итоге: • ЛРТ был назван «естественным радиомиметиком» – агентом, имитирующим действие радиации. • ЛРТ – первичные радиотоксины. • Вторичные радиотоксины – хиноны (по итогам более поздних исследований отнесены к первичным радиотоксинам), холин, гистамин, продукты автолиза.
Гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций. • 1. Базируется на концепции о решающе роли в начальных процессах лучевого поражения цепных окислительных реакций свободнорадиокального типа, субстратом для которых являются липиды (Б. Н. Тарусов, Н. М. Эмануэль). Т. К. липиды являются структурным элементом мембран, то их поражение ведет к нарушению процессов регуляции гомеостаза в клетках вплоть до гибели
Гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций. • 2. Возникновению цепных реакций способствует вызываемое облучением разрушение или ингибирование природных антиоксидантных систем, которые в норме предохраняют липиды от самопроизвольного окисления.
Недостатки гипотезы ЛРТ • 1. Постулирует наличие в клетке мишеней в виде определенной фракции липидов. • 2. Аналогия в действии ЛРТ и ИИ ограничена определенным кругом явлений, при этом установлены существенные различия: разные структурные повреждения хромосомного аппарата, отсутствует мутагенное действие ЛРТ.
Недостатки гипотезы ЛРТ • 3. Цепные разветвленные реакции in vivo пока не зарегистрированы, т. к. маловероятна возможность их развития и длительного протекания без обрыва цепи в живой многокомпонентной системе. • 4. Накопление ЛРТ количественно не связано с ЛПЭ, поэтому сложно определить ОБЭ излучения.
Недостатки гипотезы ЛРТ 5. Отсутствуют четкие количественные временные характеристики зависимости эффекта поражения от интенсивности образования ЛРТ при различных дозах излучения, не говоря уже о других радиотоксинах.
Вывод • Гипотезу липидных радиотоксинов и цепных реакций следует рассматривать как попытку объяснить одно звено в сложном патогенетическом комплексе лучевых реакций.
Структурно-метаболическая теория (А. М. Кузин, с 1965 г. ) • 1. Основная идея – под действием ИИ в клетке возникают не только радиационно-химические повреждения, но благодаря биохимическим механизмам усиления в организме синтезируются высокореакционные продукты, приводящие к дополнительному повреждению биологически важных макромолекул и образованию низкомолекулярных токсических метаболитов
Структурно-метаболическая теория • 2. Решающее значение имеют не только поражения ядерных макромолекул, но и нарушения цитоплазматических структур и их нормального функционирования. • 3. Повреждения одного или нескольких звеньев строго упорядоченной системы приводят к нарушениям мембран и сопряжения важных метаболических процессов: инактивации ферментов, расстройству управляющих систем и т. д.
Структурно-метаболическая теория • 4. В качестве токсических метаболитов признаются первичные радиотоксины (ПРТ) – вещества, образующиеся в клетках сразу или в ближайшие часы после облучения и обладающие свойством вызывать основные радиобиологические эффекты при действии на клетки или организмы.
Монография «Структурно-метаболическая теория в радиобиологии» (1986 г. ) • «…структурно-метаболическая теория является общей теорией действия радиации на биологические объекты, начиная с клеточного уровня и кончая высокоорганизованными многоклеточными организмами» . • «…рассматривает механизмы как поражающего действия летальных и сублетальных доз радиации, так и стимулирующего действия малых доз радиации. Она применима при исследовании синергизма действия ионизирующей радиации с другими физическими и химическими факторами» .
Недостатки теории Кузина. • 1. СМТ «исходит из дискретного характера передачи энергии ИИ молекулам и структурам клетки, возможного неравномерного распределения поглощенной энергии в облучаемой клетке или популяции клеток и использует «принцип попадания» только в его строго физическом смысле» – по существу изложен принцип попаданий из количественной теории
Недостатки теории Кузина. • 2. СМТ «исходя из гетерогенности и неоднозначности клеточных структур и учитывая внутриклеточные связи и зависимости, отмечает ведущую роль в формировании радиобиологических эффектов нарушений, возникающих в клеточном ядре (геноме) и биомембранах, в генерации энергии и изменении уровня низкомолекулярных биологически активных веществ (радиотоксинов)» - принцип мишеней из классики, учитывающий гетерогенность клетки.
СМТ не может быть признана универсальной по следующим причинам: • 1. Не определены количественные соотношения между накоплением ПРТ в клетке и степенью ее поражения, а сам по себе факт экспоненциального роста ПРТ с увеличением дозы и во времени, наблюдавшийся на отдельных объектах, нельзя использовать для однозначной интерпретации. • 2. Нельзя согласиться с ведущей ролью ПРТ в первичных процессах повреждения клетки, т. к. время образования токсинов смещается от момента облучения к ближайшим часам или суткам после облучения.
СМТ не может быть признана универсальной по следующим причинам: • 3. В монографии критикуются классические теории (принцип попаданий и мишеней, стохастическая теория), хотя используются их смысл. • 4. СМТ критикует концепцию «потенциальных повреждений» , однако это привело к открытию потенциальных летальных и сублетальных повреждений, а также репарации клетки, которое предсказывалось «классиками» в формальном понятии «эффективного объема» .
Выводы (о состоянии современной радиобиологической теории) • Принцип попаданий и мишеней является основополагающим, однако он претерпел серьезную модификацию: стала очевидной наряду с ролью повреждений и репарации ДНК важность повреждений и других звеньев клетки. • Ни одна отдельно взятая теория или гипотеза не объясняет механизм первичного действия ИИ. • Общий недостаток всех теорий – выдвигаемые положения не удается полностью повторить на теплокровных животных.
В заключении… • Создание единой радиобиологической теории – дело будущего, т. к. оно непосредственно связано с познанием молекулярных основ жизни.
Скачать презентацию Теоретические основы молекулярной и клеточной радиобиологии Вопросы
Лекция 3 СК 2013 теории.ppt