Тема диагностика синдрома Фукуямы Выполнил студент 571 группы

Тема: диагностика синдрома Фукуямы Выполнил: студент 571 группы отделения биофизики Жанин Илья Сергеевич Zhails@mail. ru Место прохождения практики: Научный центр здоровья детей Российской академии медицинских наук, лаборатория мембранологии с группой генетический исследований Руководитель практики: Д. м. н. профессор Пинелис В. Г.

Цели и задачи практики Цель работы – разработка метода диагностики синдрома. Фукуямы. Задачи работы: 1. Применение метода ПЦР и различных его модификаций (RT-PCR) для нахождения мутаций в гене FKTN; 2. Освоение метода секвенирования и применение его для диагностики синдрома Фукуямы

Общие сведения. Синдром Фукуямы - врождённая мышечная дистрофия, сопровождаемая лиссэнцефалией. Первые признаки возникают с рождения до 8 месяцев. Прогноз для детей с лиссэнцефалией варьируется в зависимости от степени изменения мозга. Наиболее распространенная причина смерти – проблемы с дыханием. Этиология. Причиной заболевания является повреждение гена FKTN, кодирующего трансмембранный белок фукутин, локализованного на цис-полюсе комплекса Гольджи. Этот белок участвует в процессе гликозилирования α-дистрогликана в скелетных мышцах. Ген FKTN локализован на длинном плече 9 хромосомы (9 q 31 -33), состоит из более чем 100 kb, содержит 10 экзонов.

Диагностика. 1. МРТ – пороки развития головного мозга, лиссэнцефалия, гидроцефалия, микрополигирия, аплазия мозолистого тела, уменьшение плотности белого вещества. 2. ЭЭГ – дизритмии, фокальные спайки 3. ЭМГ(Электромиография) – первично-мышечный характер поражения 4. Патоморфологическое исследование – фиброглиальная пролиферация оболочек мозга и гипоплазия кортико-спинального тракта 5. Молекулярно-генетическое исследование– различные мутации гена FKTN

Наиболее часто встречаемые мутации при синдроме Фукуямы Тип мутаций Число мутаций Миссенснонсенс 15 Малые делеции 3 Малые инсерции 2 Большие инсерциидупликации 2 Малые делеции-инсерции 1 Большие делеции 1 Сплайсинг 0 Регуляторные 0

№ Изменение в белковом составе Thr 14 Thrfs. X Гетерогомозитготы фенотип 1 Интрон позиция экзон Ex 2 c. 42 del. G het. + Arg 307 Gln Преобладающая этническая группа FCMD/LGMD European (Italian) 2 Ex 3 c. 139 C > T Arg 47 X het. + 3'ins FCMD Japanese (6 families) 3 Ex 3 c. 139 C > T Arg 47 X het. + 3'ins FCMD Chinese 4 Ex 4 c. 187_188 del. AT M 63 Vfs. X 75 het. + 3'ins FCMD European/Japanese 5 Ex 5 c. 509 C > A Ala 170 Glu het. + Tyr 371 Cys FCMD 6 Ex 5 c. 515 A > G His 172 Arg het. + 3'ins FCMD European (Portuguese) Japanese 7 Ex 5 c. 607_608 delins. TA Arg 203 X hom. FCMD Japanese 8 Ex 6 c. 748 T > G Cys 250 Gly het. + 3'ins FCMD Japanese 9 Ex 7 c. 906 T > A Cys 302 X het. + 3'ins FCMD Japanese 10 Ex 8 c. 914 G > A Trp 305 X het. + 3'ins FCMD Japanese 11 Ex 8 c. 915 G > A Trp 305 Cys hom. FCMD/MEB Turkish 12 Ex 8 c. 915 G > C Trp 305 Cys hom. FCMD/MEB Turkish 13 Ex 9 c. 1058 T > A Leu 353 X het. + 3'ins FCMD Japanese 14 Ex 9 c. 1112 A > G Tyr 371 Cys het. + 3'ins FCMD Japanese 15 Ex 9 c. 1112 A > G Ala 170 Glu het. + Ala 170 Glu FCMD 16 Ex 9 c. 1167 dup. A Phe 390 Ilefs 403 X het. + 3'ins FCMD European (Portuguese) Japanese 17 3'UTR 3’ins (c. 4392– 4393 ins. AB 185332. 1) None, effect on transcript hom. or het. FCMD Japanese Korean

Молекулярно-генетическая диагностика I. Секвенирование экзонов для нахождения однонуклеотидных замен и других мутаций в экзонах II. Real time PCR для идентификации ретранспозона в 3’ нетранслируемой области

Секвенирование экзонов Вещества Название стадии Одна °C Температура, проба (мкл) Время, с 9 проб (мкл) Число циклов Геномная ДНК 1 Подготовка к секвенированию включала 9 в себя следующие подготовительные этапы: Предварительная d. NTP денатурация 95 1. 5 90 13. 5 1 1. Выделение ДНК из периферической крови при Буфер 10 x 2. 5 22. 5 помощи Axy Prep Blood Genomic DNA Miniprep Kit 95 2. Денатурация Проведение ПЦР реакции 50 для накопления Mg 2+ 2. 5 22. 5 интересующих нас участков ДНК (экзонов) Прямой праймер 0. 3 2. 7 3. Проведение гель-электрофореза продуктов 35 ПЦРОтжиг 56 -68 40 реакции для Обратный праймер проверки на наличие контаминаций и 0. 3 2. 7 «лишних полос» , содержания нужного фрагмента в Taq-полимераза 0. 5 4. 5 Элонгация 72 45 пробе 4. Очистка ПЦР-продукта от d. NTP и «несвязавшихся» H 2 0 16. 4 147. 6 праймеров при помощи Illustra Micro. Spin Kit Финальная элонгация Общий объем 72 25 180 225 1

Секвенирование 1. Название Определение содержания ДНК в Объем, мкл после пробирках Реагент Температура, °C Время, с Число циклов стадии очистки при помощи гель-электрофореза. Сравнение свечения ДНК проб со свечением самой 13 яркой полосы Предварительн леддера. Буфер 10 х 3 96 60 1 ая Приготовление ПЦР-микса 2. денатурация RR 3 3. Амплификация Денатурация Праймер (каждый)96 10 10 4. Приготовление материала к секвенированию 1 35 Отжиг Milli-q 50 5. Проведение автоматического секвенирования на 5 генетический анализаторе ABI PRISM 3103 Движение ДНК в капилляре. 1)меченое dd. GTP, 2)меченое Общий объем 30 Элонгация 60 240 dd. ATP, 3)меченое dd. CTP, 4)меченое dd. TTP, 5) немеченая 6. Анализ данных секвенирования при помощи часть ДНК, 6) капилляр, 7) лазер, стрелкой указано программ Chromas pro и Laser. Gene направление движения ДНК

Real time PCR для идентификации ретранспозона в 3’ нетранслируемой области В исследовании были использованы две пары праймеров. Первые отжигаются на транспозоне, вторые на гене Sall 4. Этот ген является контрольным, тк его копийность относительно постоянна у человека. Люмминисцентным в этом Схема организации детектирующего красителем 1 — пробирки; 2 — амплификатора. термоэлектрические (ТЭ) модули (элементы Пельтье); 3 — радиатор; 4 — исследовании служил Sybr Green I. Связываясь с зеркало; 5 — источник света возбуждения флуоресценции; 6 — светофильтр двухцепочечными — детектор излучения он поглощает фрагментами, флуоресценции; 8 — источника возбуждения; 7 голубой свет и испускает зеленый. светофильтр детектора; 9 — излученный световой поток; 10 — световой поток возбуждения; 11 — суммарный световой поток; 12 — спектроделитель

Анализ данных V IX VI X II I Однако, даже при отсутствии мутаций в кодирующей части гена, могли быть изменения в нетранслируемых областях. Наиболее встречающаяся мутация в нетранслируемой области гена FKTN – VIII IV VII перемещение ретранспозона в 3’ III нетранслируемую область. Исследование на эту мутацию проводилось при помощи метода Real-time PCR

Проведение Real-Time PCR Реактив 1 х, мкл 8 х, мкл 1. Проведение °CПЦР Время, реакции цикловс Название стадии Температура, с Число SYBR mix 12. 5 100. 0 использованием заводского микса Предварительная Pr. F денатурация 95 0. 3 180 Денатурация ДНК 95 1 10 2. 4 1 2. Амплифицирование на CFX Real-Time Pr. R 0. 3 2. 4 PCR System 8 3. Обработка результатов на компьютере 39 H 2 O 10. 9 87. 2 Отжиг и помощи программ CFX Manager при 58 30 элонгация* Общий объем 25 200 v 1. 6, Microsoft Excel

Анализ данных С(t), номер цикла 1. Описание эксперимента в программе CFX Значение С(t) среднего для различных проб со стандартным отклонением Manager 1000 30. 00000 2. Получение графика зависимости Таким образом, доказано флуоресценции от номера цикла и наличие переместившегося 27. 00000 нормировочной кривой 3. Проведение ΔΔC(t) теста для нахождение транспозона в 3’ относительной экспрессии. 24. 00000 нетранслируемой области. 4. Проверка статистического распределения данных в программе Microsoft Excel 21. 00000 FKTN, больной SALL 4, больной FKTN, здоровый SALL 4, здоровый

Общие выводы 1. Новых мутаций в гене FKTN обнаружить не удалось 2. Была обнаружена инсерция ретранспозона в 3’ нетранслируемую область 3. По совокупности данных1 можно говорить о том, что пациент страдает синдромом Фукуямы. 1 Watanabe, M. , et al. , Founder SVA retrotransposal insertion in Fukuyama-type congenital muscular dystrophy and its origin in Japanese and Northeast Asian populations. Am J Med Genet A, 2005. 138(4): p. 344 -8. Kobayashi, K. , et al. , An ancient retrotransposal insertion causes Fukuyama-type congenital muscular dystrophy. Nature, 1998. 394(6691): p. 388 -92. , Yis, U. , et al. , Fukutin mutations in non-Japanese patients with congenital muscular dystrophy: less severe mutations predominate in patients with a non-Walker-Warburg phenotype. Neuromuscul Disord, 2011. 21(1): p. 20 -30.

Спасибо за внимание!

Список литературы • Херрингтон С. , Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Перевод с английского. – 1999. – М. : Мир, 558 с. • Примроуз С. , Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине. Перевод с английского. – 2008. – Бином. Лаборатория знаний С. 16 -20. • Ребриков Д. В. ПЦР «в реальном времени» , 2009. - Бином. Лаборатория знания, 223 с. • http: //omim. org/entry/607440? search=FCMD&highlight=fcmd дата обращения - 29. 08. 2011 • http: //gene-quantification. com/ дата обращения – 29. 08. 2011 • Watanabe, M. , et al. , Founder SVA retrotransposal insertion in Fukuyamatype congenital muscular dystrophy and its origin in Japanese and Northeast Asian populations. Am J Med Genet A, 2005. 138(4): p. 344 -8. • Kobayashi, K. , et al. , An ancient retrotransposal insertion causes Fukuyamatype congenital muscular dystrophy. Nature, 1998. 394(6691): p. 388 -92. • Yis, U. , et al. , Fukutin mutations in non-Japanese patients with congenital muscular dystrophy: less severe mutations predominate in patients with a non-Walker-Warburg phenotype. Neuromuscul Disord, 2011. 21(1): p. 2030.