Тема 9 Лекция 6 Геном бактерий Основными

Тема 9. Лекция 6. Геном бактерий

Основными экспериментальными доказательствами генетической роли ДНК послужили два эксперимента с бактериями и бактериофагами. ➲ 1. В 1944 г. О. Эвери, К. Маклеод и М. Маккарти трансформировали в пробирке непатогенный (шероховатый) штамм Pneumococcus (Streptococcus) pneumoniae с помощью экстракта патогенного (гладкого) штамма Трансформанты приобрели способность вызывать инфекцию у мышей. В этой работе авторы доказали, что трансформирующим фактором служит ДНК.

➲ 2. В 1952 г. А. Херши и М. Чейз опубликовали данные о том, что при инфицировании Е. coli бактериофагом Т 2 в клетку хозяина проникает только ДНК, т. е. именно она несет информацию, определяющую репликацию фага, структуру его белков и морфогенез последовательность азотистых оснований в составе ДНК кодирует генетическую информацию.

Компоненты ДНК ➲ Молекула ДНК построена из нуклеотидов. Каждый нуклеотид включает азотистое основание, связанное N-гликозидной связью с С 1 -атомом (обозначаемым в нуклеотидах 1') 2 -дезоксирибозы. Это нуклеозиды. ➲ Нуклеозиды, точнее 2'-дезоксинуклеозиды в случае ДНК, могут присоединять одну, две или три фосфатных группы в 3'- или 5'положениях пентозного кольца, и такие соединения называют дезоксинуклеотидами.

➲ В полинуклеотидной цепи ДНК дезоксинуклеотиды соединены 3'-5'фосфодиэфирными связями, образующимися между кольцами дезоксирибозы. ➲ Сахарофосфатный остов ДНК представляет собой последовательность из чередующихся остатков сахара и фосфата. Благодаря присутствию фосфатной группы на 5'-конце и гидроксильной группы на З'-конце цепь ДНК обладает полярностью.

Основания в составе ДНК представлены пуринами — аденином (6 -аминопурин) и гуанином (2 -амино-6 -оксипурин), и пиримидинами — цитозином (2 -окси-4 аминопиримидин) и тимином (2, 4 -диокси-5 метилпиримидин). ➲ В некоторых случаях отдельные основания после репликации модифицируются с образованием: 4 - или 5 -метилцитозина или 6 метиладенина. ДНК фагов Т 2, Т 4 и Т 6 Е. coli содержит вместо дезоксицитозина 5 оксиметилдезоксицитозин, который может дополнительно к такой модификации подвергаться гликозилированию. ➲

Пуриновые и пиримидиновые основания

➲В начале 1950 -х гг. Э. Чаргафф путем химического анализа ДНК из многих организмов обнаружил, что частота встречаемости А соответствует частоте встречаемости Т и то же самое справедливо для G и С. ➲ Величина отношения (А + Т) : (G + С) служит специфической характеристикой данного организма.

➲В 1953 г. Джордж Уотсон и Френсис Крик на основе анализа полученных М. Уилкинсоном и Р. Франклин рентгенограмм нитей ДНК и с учетом правила Чаргаффа о количественном соответствии А—Т и G—С создали модель структуры ДНК в виде двух цепей, имеющих противоположную направленность (антипараллельных) и взаимно закрученных в правостороннюю спираль, в которой гидрофобные основания обращены внутрь.

Френсис Крик Джеймс Уотсон

➲Большая часть ДНК в клетке или в растворе представлена Вформой.

В-форма ДНК Пиримидиновые основания (Т или С) спариваются с пуриновыми основаниями (А или G соответственно). ➲ Двойная спираль имеет постоянный диаметр, равный примерно 2, 0 нм. ➲ Пространственно плоские остатки оснований расположены как ступеньки лестницы, и каждая их пара повернута вокруг оси спирали на 34, 6° относительно предыдущей пары. ➲ Один полный виток составляют 10, 4 пар оснований и шаг спирали равен 3, 4 нм. ➲

➲ Сахарофосфатный остов на внешней стороне двойной спирали образует большую (главную) и малую (минорную) бороздки, в которых белки могут узнавать последовательность пар оснований. ➲В области главной бороздки связывается максимальное количество регуляторных белков.

ДНК-полимераза I , лигирующая повреждённую цепь ДНК

➲А-форма ➲ менее ДНК гидратирована и имеет более компактную структуру. ➲ плоскость остатков оснований слегка наклонена относительно оси спирали, диаметр спирали равен 2, 3 нм и на один виток приходится 11 пар оснований.

➲ In vitro в полинуклеотидных цепях с чередованием пуринов и пиримидинов при высокой концентрации солей обнаруживается Z-форма ДНК. ➲ Это единственная форма с левоспиральной конформацией, описанной для ДНК. ➲ Название Z-форма объясняется зигзагообразным расположением сахарофосфатного остова.

ДНК имеет различные конформации (топоизомеры) ➲ клетки прокариот содержат ДНК, замкнутую в кольцо (ссс. ДНК, от covalently closed circles). ➲ Молекулу ДНК, образующую плоское кольцо, называют релаксированной. ➲ Существует также сверхспирализованная форма ДНК в виде молекулы, закрученной вокруг своей оси или обвивающей белковую сердцевину и за счет ковалентного связывания концов замкнутой в кольцо.

Суперспирализованная ДНК

➲ Молекулы с одной и той же последовательностью нуклеотидов, но различной топологией, например в виде релаксированного или сверхспирализованного кольца, называют топоизомерами. ➲ Ферменты, катализирующие их взаимопревращения, имеют название топоизомеразы.

При закручивании ДНК в направлении, противоположном ориентации (по часовой стрелке) витков двойной спирали, возникает отрицательная сверхспираль. ➲ В структуре В-формы ДНК возможны небольшие вариации, угла поворота одной пары оснований относительно другой с изменением числа пар оснований, приходящихся на один виток спирали, в пределах 10 -10, 5. Угол, образуемый парой оснований с осью спирали, может отклоняться от нормы, соответствующей 90°, и ось спирали смещаться. ➲

репликация ДНК Цепи ДНК, содержащие одинаковую информацию, разделяются, и каждая из них служит матрицей для синтеза комплементарной цепи (модель «застежкамолния» ). Этот механизм назван полуконсервативной репликацией. ➲ Репарационная репликация (репарационный синтез ДНК) происходит на небольших участках, где родительская ДНК в одной цепи замещается вновь синтезированной ДНК. ➲ Локальный синтез ДНК, при котором матрицей служит комплементарная цепь, имеет место при гомологичной рекомбинации, и в этом случае его называют дисперсивным синтезом ДНК ➲

➲ При синтезе двухцепочечной ДНК одна цепь (ведущая) синтезируется непрерывно, тогда как другая цепь — небольшими порциями (фрагменты Оказаки), начиная с РНКзатравки, синтезируемой в обычном направлении (5' —> 3') и имеющей свободный З'-ОН-конец. ➲ Относительно движения репликационной вилки синтез фрагментов Оказаки (5' —> 3') происходит в противоположном направлении. Данную цепь называют запаздывающей или отстающей, поскольку синтез очередного фрагмента Оказаки становится возможным только после освобождения участка матрицы в результате наращивания ведущей цепи.

➲ Механизм синтеза ДНК называют полуконсервативным и полунепрерывным.

В клетках подавляющего большинства прокариот не обнаружено гистонов, поэтому нейтрализация зарядов осуществляется взаимодействием ДНК с полиаминами (спермином и спермидином) и с 2+ ионами Mg. В последнее время у некоторых архебактерий и цианобактерий обнаружены гистоны и гистоноподобные белки, связанные с ДНК.

Гистоноподобные белки ➲ Белки HU, IHF (от integration host factor), FIS (от factor for inversion stimulation) и HNS (от histon-like nucleoid structuring protein) выполняют структурную (морфопоэтическую) роль в формировании инициаторного комплекса. ➲ Они (особенно FIS и IHF) необходимы для того, чтобы сильно изогнуть ДНК, например в процессе инициации транскрипции или произвести вырезание либо интеграцию фаговой ДНК.

Взаимодействие фактора транскрипции STAT 3 с ДНК

➲В 1963 г. Ф. Жакоб, С. Бреннер и Ф. Кюзен разработали модель репликона, основанную на предположении, что каждая способная автономно реплицироваться молекула ДНК (репликон) содержит «репликатор» — сайт ДНК в -цис-положении (теперь называемый точкой начала репликации), на который действует инициаторный белок.

➲В бактериальной клетке наиболее крупный репликон — это хромосома. ➲Автономно реплицироваться способны плазмиды и фаговые ДНК, также представляющие собой репликоны.

➲ У большинства прокариот гены, необходимые для жизнедеятельности и определяющие видовую специфичность, расположены линейно в единственной, ковалентно замкнутой кольцевой молекуле ДНК, называемой хромосомой. ➲ Цитологический термин — хромосома — по своему значению не эквивалентен в применении к прокариотам генетическому термину геном, который в данном случае означает сумму всех генов клетки, находящихся не только в хромосоме, но также в плазмидах или бактериофагах.

Изолированный нуклеоид E. coli.

Первой была получена с помощью методов генетического анализа с использованием конъюгации и трансдукции, генетическая карта Е. coli.

➲у Streptomyces и Borrelia хромосомы линейные (и более крупные, 7, 8 т. п. н. и 9, 5 т. п. н. соответственно), у Burkholderia cepack в клетках присутствуют три кольцевые хромосомы (3, 6; 3, 2 и 1, 1 т. п. н. ).

➲ Репликация типичных хромосом, подобных хромосомам Е. coli или В. subtilis, начинается с единственной точки начала репликации (ori. C) и происходит в двух направлениях до конечной точки.

➲ Бактериальные хромосомы отличаются от эукариотических относительно низкой степенью конденсации, зависящей от белков. ➲ Бактериальная ДНК не организована в нуклеосомы и не окружена мембраной, но компактно локализована в определенной области, называемой нуклеоидом, и покрыта гистоноподобными белками, в частности HU и HNS (белки, структурирующие нуклеоид), однако менее плотно, чем ДНК в клетках эукариот.

➲ Область нуклеоида в цитоплазме почти не содержит рибосом. Нуклеоид имеет крупные размеры относительно размеров бактериальных клеток (у Е. coli— 1, 3 мм против З мкм). ДНК в нем плотно упакована и малодоступна для действия ферментов. ➲ Транскрипция возможна не в основной массе ДНК, а только на поверхности нуклеоида. ➲ Сверхспирализованные петли проникают в области цитоплазмы, содержащие РНКполимеразу и рибосомы, и вся структура нуклеоида весьма динамична. ➲

Плазмиды ➲ Плазмиды представляют собой репликоны и в случаев замкнуты в независимые большинстве кольцо. ➲ Размеры природных плазмид варьируют от 1 т. п. н. до нескольких сотен т. п. н. ➲ Исключение составляют представители Streptomyces, Borrelia и Rhodococcus, у которых обнаружены линейные плазмиды.

Молекулярная организация плазмид ➲ Базовый репликон (basic replicon): ➲ ori (origin) inc/cop - ген (ы) rep – ген система разрешения коинтегратов (mrs - multimer resolution system), система активного распределения плазмид (par – partitioning), система постсегрегационной гибели клетки (PSK – post segregational killing). система рестрикции – модификации (RM). Жизненно – важные структуры плазмиды (backbone segment) ➲ ➲ Система конъюгационного переноса. Гены резистентности. Гены биодеградации. Другие гены.

➲ ➲ ➲ Плазмиды - внехромосомные элементы наследственности, способные к автономной репликации. Термин введен Ледербергом в 1952 году. Эписомы – генетические элементы, способные реплицироваться в двух альтернативных состояниях: в интегрированном в хромосому и независимо от хромосомы. Конъюгативные плазмиды – способны обеспечивать перенос ДНК путем конъюгации. Неконъюгативные плазмиды – не способны обеспечивать перенос ДНК путем конъюгации. Мобилизуемые плазмиды – способны передаваться в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Криптические плазмиды – плазмиды, фенотипические признаки для которых не установлены.

➲ По договоренности крупные плазмиды называют хромосомами, если они содержат гены «домашнего хозяйства» (за исключением F' или R'-плазмид). ➲ Такие плазмиды образуются в результате неточного вырезания эписом (плазмид, способных включаться в хромосому) из сайтов хромосомной локализации.

➲ Единой номенклатуры плазмид пока не разработано. ➲ Их обозначения включают начальную букву «р» , за которой следуют инициалы автора и число (p. BR 322) или буквы, обозначающие функцию плазмиды (р. ЕХ для экспрессируемого вектора). ➲ Обозначения плазмид, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, половых факторов или колицинов, не содержат начальной буквы «р» (например, R 100, RSF 1010, F, mini-F, Col. E l).

➲ Колициногенная плазмида p. BR 322

➲ Плазмиды — это независимые генетические элементы, содержащие дополнительные гены (необходимые лишь в специфических условиях). ➲ Плазмиды реплицируются автономно. ➲ Особые плазмиды, эписомы, способны, помимо того, включаться в хромосому.

➲ Репликация различных плазмид осуществляется разными способами. ➲ Независимо от способа репликации плазмиды контролируют количество своих копий, т. е. скорость их репликации соответствует скорости репликации хромосомы, благодаря чему количество копий остается постоянным. ➲У разных плазмид оно может существенно варьировать, от 1 копии на хромосому до более чем 100 копий, но для каждой плазмиды число копий относительно

Все изученные плазмиды контролируют собственную репликацию, и количество копий по механизму отрицательной обратной связи на уровне инициации репликации. ➲ В регуляции участвуют три трансактивных элемента, действующих по отдельности или совместно. ➲

Один - небольшой антисмысловой транскрипт РНК, ➲ Второй - репрессор гена Rep. ➲ Третий элемент — набор коротких повторяющихся последовательностей, которые связывают белок Rep и предотвращают инициацию транскрипции. ➲

Плазмиды состоят из модулей: ➲ - основной репликон, содержащий точку начала репликации, и гены, обеспечивающие и контролирующие протекание репликации. ➲одну или большее число систем распределения. ➲ - функцию переноса ( у более крупных (конъюгативных) плазмид) — горизонтальной передачи плазмиды другим клеткам данной бактерии или другим бактериям. ➲ Эти три модуля ответственны за поддержание и распространение плазмид. ➲

➲ В случае регуляции по механизму отрицательной обратной связи плазмиды с одним и тем же типом контроля репликации или системы распределения несовместимы, т. е. в данной популяции клеток невозможна стабильная репликация двух типов плазмид. ➲ В то же время плазмиды с разными типами контроля инициации вполне совместимы. ➲ Несовместимость определяется свойством основного репликона плазмиды.

➲ На характеристике несовместимости основана классификация плазмид — подразделение их на группы несовместимости: Inc. P (RP 4, RK 2), Inc. FI (F, Col. V), Inc. FII (Rl) и Inc. Y (фаг PI). ➲ Группы несовместимости (Inc – incompatibility): 14 групп в системе Pseudomonas (Inc. P-1 – Inc. P-14) 30 групп в системе Enterobacteriaceae

➲ Сохранение плазмид в бактериальных популяциях обеспечивают различные генетические системы распределения и зависимости. ➲ Для мультикопийных плазмид такие специальные системы не обязательны, но в случае плазмид, присутствующих в виде одной или небольшого числа копий, они необходимы. ➲ Однокопийные плазмиды утрачиваются из бактериальной популяции с частотой менее 1 СР 7 в пересчете на клеточный цикл.

➲ Специальные системы распределения ➲ обеспечивают в процессе деления клетки попадание хотя бы одной плазмиды в каждую дочернюю клетку. ➲ Изученные к настоящему времени системы этого типа включают два белка, действующих по транс-типу, и цис-активный сайт в молекуле ДНК.

➲ Системы зависимости ➲ Их действие основано на том, что несущая плазмиду бактерия выживает только при условии, что она сохраняет эту плазмиду. ➲ Гибель клетки при утрате плазмиды обеспечивается способностью плазмиды продуцировать «яд» и «противоядие» .

➲ Плазмиды существенно различаются в отношении круга хозяев. ➲ Узкоспецифичные, ограниченные в своем распространении только одним видомхозяином. ➲ Широкоспецифичные, такие как плазмида RP 4, способная переноситься практически в любые грамотрицательные бактерии.

➲ Плазмиды с узкой специфичностью используют аппарат репликации хозяина. ➲ При широкой специфичности плазмиды обычно несут гены большинства собственных белков, участвующих в репликации: гены, сайты и механизмы, ответственные за горизонтальное распространение плазмид путем конъюгации и мобилизации.

Известны природные плазмиды, состоящие только из основного репликона и не оказывающие заметного влияния на фенотип клетки-хозяина; они получили название криптических. ➲ Большинство плазмид кодирует определенные функции, позволяющие клеткам-хозяевам выживать в тех или иных условиях среды. ➲ Этим свойством плазмид в большой степени обусловлена физиологическая вариабельность бактерий. ➲

➲ Механизмы такого чрезвычайно стабильного наследования плазмид в популяциях бактерий действуют на трех уровнях. ➲ Часто плазмиды обладают несколькими системами сохранения.

➲ Устойчивость к антибиотикам обусловлена генами, находящимися в составе плазмид резистентности, или R -плазмид. ➲ Плазмиды несут гены вирулентности или токсинов; ➲ обусловливают образование пилей (фимбрий), ➲ несут гены белков - бактериоцины, вызывающие гибель бактерий того же вида или родственных видов, но не оказывающие действия на сами клетки (колицины),

➲ гены, синтезирующие антибиотики (у актиномицетов), ➲ кодируют рестрицирующие эндонуклеазы и родственные метилтрансферазы (защита от фаговой инфекции или внедрения чужеродной ДНК). ➲ Плазмиды деградации обеспечивают метаболирование разнообразных веществ.

➲ Плазмиды, обеспечивающие взаимосвязь с специфическую растениями. ➲Вид Agrobacterium tumefaciens, содержащий крупную (примерно 500 т. п. н. ) Ti-плазмиду (tumor-inducing plasmid). ➲симбиоз растений с азотфиксирующими бактериями, ➲ - гены nod/vir, необходимые для образования клубеньков.

транспозирующиеся (мобильные) элементы ДНК ➲ способны непосредственно перемещаться из одного сайта в другой внутри хромосомы или во внехромосомную ДНК в пределах одной клетки путем «незаконной рекомбинации» . ➲ транспозоны, названные конъюгативными, могут перемещаться в другие клетки в процессе,

➲ Транспозирующиеся элементы непосредственно влияют на геном хозяина, поскольку внедряются внутрь генов или в близко прилегающие участки, нарушая генную структуру или подчиняя экспрессию этих генов новым регуляторным элементам.

➲ Рекомбинация между копиями одного и того же мобильного элемента может приводить к делециям, дупликациям, амплификациям, инверсиям и транспозициям сегментов генома или к слиянию независимых репликонов. ➲ Мобильные элементы вызывают многие хромосомные мутации и обусловливают их высокую частоту.

➲ Простые транспозоны (IS-элементы) содержат на концах инвертированные последовательности и кодируют фермент транспозазу, катализирующую их перенос. ➲ Сложные транспозоны содержат на концах инвертированные повторы, иногда в виде IS-элементов, и включают, кроме гена транспозазы, дополнительные гены.

Структурная организация некоторых подвижных элементов.

Инсерционные последовательности (ISэлементы) — простейшие мобильные элементы ➲ Инсерционные (вставочные) последовательности широко распространены в клетках прокариот, их фагах и плазмидах. ➲ Были открыты в начале 1970 гг. П. Старлинжером, Г. Седлером и Дж. Шапиро при изучении мутаций необычного типа. ➲ Размеры IS-элементов варьируют в пределах 750 -1550 п. н.

➲ Сложные транспозоны подразделяют на два класса. ➲ Транспозоны класса I содержат на концах полноразмерные ISпоследовательности и перемещаются посредством нерепликативного механизма вырезания и встраивания, способны перемещать расположенные между ними маркеры.

➲ Транспозоны II класса имеют короткие (38 п. н. ) инвертированные повторы на концах (не IS-элементы); расположенная между ними последовательность кодирует транспозазу. ➲ Перемещаются с помощью репликативного механизма с образованием промежуточного продукта — коинтеграта.

➲ Основные механизмы транспозиций. а - Схема репликативной транспозиции. ➲ б - схема нерепликативной транспозиции. ➲ в - упрощенная схема цикла транспозиции у ретротранспозонов. ➲

➲ IS-элементы и транспозоны обеспечивают пластичность генома, важную для эволюции хромосом и плазмид, и служат инструментами для сохранения «коллективного генома» бактерий, т. е. всей суммы генов, характеризующих данный вид. ➲ Коллективный геном осуществляют гены, присутствующие в отдельной клетке, плюс все гены, доступные для горизонтального переноса между штаммами.

След, оставляемый транспозоном

➲ Отдельная клетка Е. coli содержит лишь примерно 80% всей суммы генов, имеющихся у различных штаммов этого вида, т. е. коллективный геном больше по размерам, чем индивидуальный, и характеризует вид полностью на генетическом уровне.