Тема 3. Способы и системы культивирования микроорганизмов

Тема 3. Способы и системы культивирования микроорганизмов 1. Кинетика ферментативной реакции. 2. Способы культивирования микроорганизмов 3. Системы культивирования микроорганизмов 4. Методы, используемые в этапах биотехнологического производства. 5. Правила составления сред для культивирования микроорганизмов 6. Влияние физико химических и биологических факторов на синтез микроорганизмов

1 ВОПРОС. Кинетика ферментативной реакции Преимущества использования микроорганизмов в качестве продуцентов различных продуктов: • 1. Лабильность к физико химическим и биологическим факторам. • 2. Разнообразие их ферментных систем и возможность увеличить биосинтез веществ с помощью селекции, подбора среды и условий культивирования. • 3. В сотни раз продуктивнее животных и растений. • 4. Получение продуктов, производство которых химическим путем невозможно, сложно, дорого. • 5. Исходным материалом может быть доступное, дешевое сырье, отходы переработки АПК.

Особенности микроорганизмов как объектов селекции: • Выращивание микробной культуры из одной клетки. • Гаплоидность(с одним набором хромосом), поэтому у них нет скрытой изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов. • Нет способности к гибридизации (половому размножению). • Быстрая смена поколений. • Огромное число индивидуумов для отбора.

3. ВОПРОС. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАЦИИ Экспоненциальная скорость роста микроорганизма – скорость, при которой интервалы между удваиваниями массы и числа клеток во времени остаются постоянными. • d. X/d. T= Мμ или d. N/d. T= μN • X концентрация клеток, г/дм 3 • T время, ч • Мμ удельная скорость роста клеток, ч 1 (по массе) • N концентрация клеток, клеток/дм 3 • μN удельная скорость роста клеток, ч 1 (по количеству).

Разновидности роста микроорганизмов: • Бактерии размножаются непосредственно делением, клетка удваивает и массу, и количество всех составляющих компонентов. • Дрожжи – почкованием, почка на материнской клетке, растет пока не достигнет размеров материнской и отпочковывается. • Мицелиальные грибы – путем удлинения и разветвления грибных цепочек, рост от конца мицелия путем образования мостиков между клетками, различны по возрасту. • Микробные вирусы или фаги – требуют наличие хозяина.

Форма клеток Дрожжевая клетка дрожжей в процессе почкования.

Рис. Дрожжи: 1 — отдельная клетка; 2— 5 — почкование клеток; б — сумка с четырьмя сумкоспорами.

• Aspergillus flavus

Реniсillium

Virus-rossmann Virus-influenza

Фазы роста периодическая культуры микроорганизмов.

Все периодические процессы ферментации делят на 3 типа: • Между потреблением субстрата и накоплением продукта постоянное соотношение. Здесь механизм роста совпадает с максимальным накоплением продукта. (рис. 2. 12). Так получают этанол, молочную кислоту. • Продукт образуется в ходе энергетического метаболизма непрямым путем: за счет побочных реакций или при взаимодействии первичных метаболитов между собой Кривая имеет сложный вид, максимальные значения продукта и массы не совпадают (рис. 2. 13). • Продукт образуется независимым путем. Максимум роста культуры в начале ферментации, а максимум продукта на затухающую фазу. Так образуются вторичные метаболиты. (антибиотики стрептомицин, пенициллин). В несменяемой культуре встречаются кривые смешанного типа, когда одни клетки синтезируются по 1 типу, другие по 2 му.

2 ВОПРОС. Способы культивирования микроорганизмов Культивирование продуцентов включает несколько взаимосвязанных операций: • Выбор способа • Оптимизацию компонентного состава и подготовка питательных сред на основе экологических принципов • Получение инокулята или посевного материала, начиная с чистой культуры • Стадия ферментации (выращивания с образованием продуктов) • Выделение и очистку целевого продукта • Придание продукту товарной формы. • Культивирование осуществляется с целью получения биомассы или продуктов метаболизма.

Способы культивирования микроорганизмов Метод Микроорганизмы культивирования In vivo: Облигатные паразиты: ►Культура клеток ►Риккетсии ►Птичий эмбрион ►Хламидии ►Организм животного ►Вирусы In vitro: Почти все патогенные ►Искусственные бактерии питательные среды

Биореактор, ферментер или ферментатор – это закрытая или открыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, р. Н среды и т. д. ) протекает на клеточном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов. Периодический процесс включает: а) стерилизацию сред, биореакторов и вспомогательного оборудования; б) загрузку аппарата питательной средой; в) внесение посевного материала (клеток, спор); г) рост культуры, который может совпадать во времени со следующим этапом или предшествовать ему; д) синтез целевого продукта; е) отделение и очистку готового продукта. Речь идет о вре менной последовательности этапов, по окончании последнего этапа проводится мойка биореактора и его подготовка к новому циклу. Есть периодическое культивирование с подпиткой и отъемнодоливочное.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Способы культивирования: • Поверхностный – на твердых, сыпучих средах, на поверхности тонкого слоя жидкой среды. • Глубинный – наиболее перспективен в специальных емкостях – ферментаторах с термостатирующими, аэрирующими, перемешивающими, регулирующими р. Н устройствами. • Периодический глубинный – без смены среды, одновременно загружая среду и посевной материал. • Непрерывное глубинное культивирование- поддерживаются постоянные условия среды, микроб остается в определенном физиологическом состоянии, т. к подается свежая питательная среда и удаляется избыток ее с продуктами метаболизма. Клетки в состоянии экспоненциального роста, нет смены фаз, открытая система. • Гомогеннонепрерывный процесс - использутся один ферментатор, если гетерогеннонепрерывный процесс – несколько ферментаторов.

Поддержание динамического равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: • Турбиностатным принцип – концентрация биомассы поддерживается скоростью потока среды, контролируется концентрация суспензии входящей жидкости, создаваемой микробами с помощью фотоэлемента и р. Н электрода. • Хемостатный контроль – по входящему потоку с перемешиванием. При добавлении объемов среды время перемешивания должно быть минимальным.

Вопрос 3. Системы культивирования микроорганизмов Система называется закрытой, если ни одна составная часть этой системы после начала процесса в биореакторе не вводится и не выводится. Развитие управляемых периодических процессов привело к созданию объемно- доливочной системы: в процессе культивирования главные компоненты среды добавляют дробно, чем исключают субстратное ингибирование. Никакие жидкие компоненты из среды не отводят. Открытые системы работают в непрерывном потоке. В процессе реакции часть отработанной питательной среды из биореактора удаляют и добавляют новую, что обеспечивает непрерывность процесса.

Вопрос 4. Методы, используемые в этапах биотехнологического производства 1. Методы хранения посевного материала. Лиофильное высушивание (обезвоживание после замораживания при температуре – 40 60 °С и ниже). Применяется в отношении продуцентов антибиотиков. а) Высушивание на воздухе в стерильной среде (на почве, бумаге, дисках агара и т. д. ). б) Сохранение спор (пригоден для спорообразующих бактерий рода Вacilus). в) Криоконсервация – глубокое замораживание клеток с их последующим хранением в жидком азоте (-96°С) или в парах азота ( -155°С).

Методы получения Чистой культуры Чистая культура – культура, полученная из одной клетки и являющаяся ее потомством. Есть 3 способа получения ЧК: • Метод Пастера – постепенное разбавление культуры стерильным раствором до того, пока в капле не останется одна клетка, которую засевают в колбу с питательной средой. • Метод Коха – разведение культуры микроорганизмов в 4 5 пассажах (пересевах) расплавленной твердой средой, в пробирке получают одну клетку, которая дает потомство в чашке Петри. • Метод истощающего посева – капля материала в чашку шпателем по поверхности разносится, потом им же во второю, 3 ю и т. д. На поверхности вырастают колонии отдельных клеток.

Стадии биотехнологического процесса и методы, используемые на основные стадиях

• Стадия 1. Подготовительная • Стадия включает этапы: приготовление и стерилизация среды, подготовка посевного материала, подготовка биокатализатора, обработка сырья. • Методы – стерилизации, методы составления сред, гидролиз первичного сырья.

Стадия 2. Основные биотехнологические стадии • Этапы стадии: • Рост микроорганизмов и синтез ими целевого продукта, • Изменение продукта после его синтеза. • Методы – ферментация, биотрансформация, биокатализ. • Стадия 3. Разделение биомассы микроорганизмов и культуральной жидкости • Методы – сепарация (флотация, фильтрация, центрифугирование).

Стадия 4. Разрушение клеток. • Методы – физического, химического и химико ферментативного разрушения. Стадия 5: выделение целевого продукта. • Методы – осаждения, экстракция, адсорбция. Стадия 6. Концентрация, обезвоживание, модификация и стабилизация продукта. Методы- обратный осмос, ультрафильтрация, выпаривание, сушка, химическая модификация, добавление наполнителей.

Стадия 7. Изготовление готовой формы • Таблетирование, дражирование, розлив, фасовка, гранулирование, ампулирование

ВИДЫ ПРОДУКТОВ ПО ИХ МЕСТУ В ТИПОВОЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЕ 1. Продуктом являются газы со стадии ферментации (диоксид углерода в спиртовом производстве, биогаз в переработке отходов путем метанового брожения). 2. Продукт — среда ферментации: культуральная жидкость вместе с микроорганизмами (например, кефир, йогурт) или твердый субстрат (ферментированная с заквасками колбаса). 3. Концентрат культуральной жидкости — выпаренный или высушенный (кормовой лизин или кормовые антибиотики). 4. Жидкость, получающаяся после отделения биомассы от культуральной жидкости. (пиво, вино, квас). 5. Концентрат жидкости (см. п. 4), получаемый с помощью выпаривания, сушки или ультрафильтрации. 6. Биомасса инактивированная (кормовые дрожжи, которые на завершающих стадиях подвергаются тепловой стерилизации). 7. Биопрепарат — жизнеспособная биомасса микроорганизмов (пекарские дрожжи, бактериальные средства защиты растений, биодеструкторы нефтяных загрязнений, бактериальные удобре ния, силосные закваски и т. п. ).

8. Ослабленная биомасса микроорганизмов (живые вакцины). 9. Внеклеточный биопродукт — легкокипящая жидкость (этанол) 10. Внеклеточный биопродукт — твердое вещество или высококипящая жидкость, растворенные в культуральной жидкости (многие медицинские антибиотики, чистые пищевые или медицинские аминокислоты, лимонная кислота). 11. Внутриклеточный продукт (различной степени очистки — многие антибиотики, витамины, нуклеотиды). 12. Переработанная биомасса микроорганизмов (гидролизаты и ферментолизаты, используемые как источники кормления животных или как вкусовые добавки; клеточные оболочки, получаемые после разрушения микроорганизмов и применяемые как сорбент для очистки соков, вина, пищевых жидкостей). 13. Очищенный от загрязнений поток жидкости (при очистке сточных вод). 14. Очищенная от загрязнений твердая среда (почва при микробиологической очистке ее от нефтяных загрязнений). 15. Жидкая среда (культуральная жидкость) с экстрагированными (выщелоченными) из твердой фазы компонентами (бактериальное выщелачивание металлов из руд). 16. Среда ферментации (обычно полутвердая), увеличившая свой объем за счет выделения газов микроорганизмами (хлеб, сыр).

Вопрос 5. Правила составления сред для культивирования

Содержание некоторых веществ в кукурузном экстракте Среды для культивирования. • Основной принцип – удовлетворение физиологических потребностей микроорганизмов. В каталогах и определителях культур указаны эти потребности и оптимальные значения р. Н и температуры. Концентрация определяется с учетом коэффициента конверсии в биомассу (Y x/s, Yp/s). Ух конверсии для метанола и глюкозы=0, 5, этанола – 0, 75, жидких парафинов – 1, 2 1, 3, гексадекана 1 1, 1. Для выращивания 30 г биомассы в 1 л среды надо внести 60 г метанола, 40 г этанола, 24 жидких парафинов, 30 г гексадекана. Выше концентрации токсичны. , выше 7 8% концентрации сахарозы, глюкозы, фруктозы тормозят рост большинства микроорганизмов, поэтому они вносятся постепенно. Количество вносимого азота определяют по количеству его в биомассе. Точную потребность в минеральном питании определяют после культивирования в синтетических средах из компонентов в чистом виде (перекристализованные соли) и дистиллированной воды.

Для составления рецептур компоненты взяты в соотношениях, пропорциональных потребностям культуры, с учетом предполагаемой продуктивности биомассы по формуле. Сi = C 1 = C 2 = S 0 Ai A 1 A 2 Сi- концентрация компонента в сбалансированной среде (i= 1, 2. . п), А – коэффициенты конверсии.

Классификация искусственных питательных сред • По консистенции – Жидкие – Полужидкие (0, 5% агара) – Плотные (1, 5 2% агара, свернутые)

Классификация искусственных питательных сред • По составу – Натуральные • простые – мясо пептонный агар и бульон (МПА и МПБ) – желатин – молоко – кусочки овощей • сложные простые + добавка – Синтетические

Классификация искусственных питательных сред • По назначению – Основные • Универсальные (простые натуральные) • Специальные (сложные натуральные) – Элективные (селективные) – Дифференциально диагностические – Консервирующие

ВОПРОС 6. Влияние физико-химических и биологических факторов на синтез микроорганизомов Физико-химические факторы: • ВЛАЖНОСТЬ • ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ • ТЕМПЕРАТУРА • МОЛЕКУЛЯРНЫЙ КИСЛОРОД • КИСЛОТНОСТЬ СРЕДЫ. • ОКИСЛИТЕЛЬНО ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ. • ХИМИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА.

Биологические факторы, влияющие на продуктивность микроорганизмов А) Симбиоз – тесное совместное существование разных видов. Виды симбиоза: • Эктосимбиоз - микроорганизм имеет внешнее положение по отношению к хозяину. • Эндосимбиоз –развивается внутри. • Синатропные организмы – существование рядом с человеком (возбудители болезней). По относительной выгоде, получаемой партнерами выделяют: • мутуалистический симбиоз – оба сожителя получают взаимную пользу, в совместном развитии большую. Виды мутуализма: • Метабиоз – продукты обмена одного микроба – питательная среда другого. • Комменсализм – не ярко выраженная форма, пользу получает один партнер. Б) Нейтрализм нет влияния партнеров В) Антагонизм – один угнетает другой и вызывает гибель. • 1. Пассивный – более быстрое использование питательных веществ одним если сходные потребности (бактерии подавляют актиномицеты при совместном культивировании). • 2. Паразитизм (хищничество) - использование в качестве питания клеток конкурента (ацидофильная палочка при недостатке питания выделяет в среду протеазы и разрушает стрептококки, всасывает продукты разложения. • 3. Активный антагонизм (антибиоз)– образование продуктов обмена, которые вызывают подавление развития и гибель организмов под влиянием веществ, образуемых конкурентами. Молочно-кислые бактерии обр. молочную кислоту, которая подавляет гнилостные. Уробактерии – аммиак, дрожжи – спирт.

Рис. Кухонная мочалка под микроскопом. Сама губка имеет темно-зеленый Рис. Современная цвет. Синим цветом окрашены бактерии, желтым – фотография дрожжеподобные грибы, микроорганизмов розовым и фиолетовым – волокнистые грибы во рту человека