ТЕМА 3 МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ 1

ТЕМА 3 МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

1. Общая характеристика системы регуляции • На деление клеток могут действовать самые разные факторы: биогенные и абиогенные, химические и физические, непосредственные и опосредованные, стимуляторы и ингибиторы: – влияющие на синтез нуклеотидов, ДНК, РНК, белков; – влияющие на синтез и накопление АТФ (энергетический «резервуар» митоза), особенно ингибиторы гликолиза и дыхания; – влияющие на формирование митотического веретена. • Это могут быть неспецифические факторы, модифицирующие цикл, часто побочные (температура, оксигенация, токсины и др. ). • Нас интересуют здесь специфические регуляторные факторы, специально предназначенные для управления клеточным циклом. Очевидно, что в гистогенезах изменения параметров цикла, задержки в G 0, выход в дифференцировку – это отражение действия каких-то регулирующих факторов. • Действие таких регуляторов возможно в точках повышенной чувствительности (точка r, check points) клеточного цикла.

• Механизм регуляции клеточного размножения – системный. Он состоит из многих параллельных и, в то же время, иерархичных звеньев регуляции. У многоклеточных животных (наиболее сложная система) он включает следующие уровни регуляции: 1) Клеточные регуляторы: ядерные (генетические), цитоплазматические (вторичные мессенджеры), мембранные (рецепторы); 2) Организменные регуляторы: гуморальные местные, тканеспецифические (факторы роста, ингибиторы), гуморальные дистантные, ткане- и видонеспецифические (гормоны – стимуляторы и ингибиторы), нервные, от ЦНС через гипоталамус на аденогипофиз и далее на местные эндокринные железы; 3) Средовые регуляторы: через ЦНС, непосредственные абиотические, модифицирующие (тепло и др. ).

• NB: На разных уровнях регуляции есть как стимуляторы (+), так и ингибиторы (-). Давно существовало 2 противоположных взгляда на сам принцип регуляции митозов: • Митогенная регуляция: нормальное состояние клетки – покоящееся, а для деления необходимы стимуляторы, митогены. • Ингибиторная регуляция: нормальное состояние клетки – непрерывная пролиферация, которая ограничивается ингибиторами. • Что верно? Или все сложнее?

2. Доказательства генетического контроля цикла • Установлено, что последовательность фаз митотического цикла (-G 1 -SG 2 -M-) контролируется периодической активностью определенных генов. В крайнем выражении эта закономерность известна как принцип домино: очередной ген включается продуктами предыдущего гена. • Доказательства генетического контроля цикла складывались из разных фактов, экспериментов: цитологических, биохимических, генетических. 2. 1. Опыты по слиянию клеток He. La Разработаны методы гибридизации (слияния) клеток. Получение гетерокарионов – клеток с различающимися ядрами. Объединяли гомологичные однолинейные клетки (культура He. La), но находящиеся в разных фазах митотического цикла (гетерофазные клетки). • Показали наличие фазово-специфических индукторов и ингибиторов митотического цикла.

1) S + G 1 В G 1 -ядре сразу начинается синтез ДНК. Вывод: G 1 -ядро готово к репликации, но ее начало зависит от присутствия какого-то индуктора, который образуется на границе G 1/S. В опыте G 1 -ядро получает его от цитоплазмы S-фазной клетки. Т. о. , для запуска S-фазы требуется некий индуктор синтеза ДНК – SPF (Synthesis Promoting Factor). 2) S + G 2 В G 2 -ядре новый синтез ДНК не стимулируется, даже с помощью дополнительного SPF (от S-фазной клетки), реплицированные хромосомы не восприимчивы к SPF. Ожидаемый в G 2 -ядре митоз задерживается, пока не закончится синтез ДНК в S-ядре. Вывод: в G 2 -ядре ДНК защищена от повторной репликации специальным ингибитором – SDF (Synthesis Delaying Factor). Для запуска митоза необходим М-индуктор? В опыте он разбавляется цитоплазмой S-клетки?

3) G 1, S, G 2 + M В интерфазном ядре начинается преждевременное разрушение ядерной оболочки и конденсация хромосом (инициация митоза, наиболее полная в G 2 -ядре). Вывод: в цитоплазме М-клетки присутствует в высокой концентрации некий индуктор митоза – MPF (Mitosis Promoting Factor). (по: Ченцов, 2004)

4) G 1 + G 2 G 1 -ядро проходит цикл по графику, в G 2 -ядре блокируется начало митоза. Вывод: митоз начинается лишь при критическом уровне MPF (в опыте он разбавляется G 1 -клетой). Возможно также присутствие в цитоплазме сигнала задержки митоза – MDF (Mitosis Delaying Factor). (Показана задержка митоза избытком одноцепочечной ДНК). Т. о. , смена периодов митотического цикла контролируется выработкой и накоплением в определенных концентрациях специальных индукторов и ингибиторов цикла: - SPF – активатор синтеза ДНК, - SDF – S-задерживающий фактор, - MPF – М-стимулирующий фактор, - MDF – М-задерживающий фактор. • Регулярная смена этих факторов в цитоплазме и кариоплазме разграничивает ряд событий хромосомного цикла, предотвращая неувязки (вроде конденсации хромосом посреди S-фазы или повторной репликации перед митозом). • Каковы же природа и происхождение этих факторов?

2. 2. Опыты по ингибированию синтезов РНК и белка в цикле – ингибиторный анализ для выявления возможной роли РНК и белков в регуляции митотического цикла (Епифанова, 1973). Опыты на клеточных культурах, синхронизированных по циклу. Синтезы РНК и белков блокировали соответствующими ингибиторами: - ингибитор синтеза РНК – антибиотик актиномицин D (связывается с ДНК и блокирует транскрипцию). - ингибитор синтеза белка – пуромицин (блокировка связи м. РНКт. РНК) или циклогексимид (блок м. РНК-рибосома). Ингибиторы добавляли в культуру в точно известное время до ожидаемого наступления S-периода или митоза и регистрировали время наступления их задержки.

Результат 1. Запуск S-периода. Если перед самым началом ожидаемого S-периода блокировать синтез белков, то репликация ДНК не наступает (даже кратковременная блокада задерживает начало S). Блокада синтеза РНК эффективна на более ранних сроках (1 ч до начала S и раньше). Следовательно, для инициации репликации ДНК необходимо: (1) перед самым началом S-периода – синтез какого-то белка, это SPF; (2) м. РНК для этого синтезируется за 1 -2 ч до начала S; (3) р. РНК для рибосом, обеспечивающих этот синтез белка, образуется раньше, в G 2 -периоде предыдущего цикла.

Результат 2. Запуск митоза. Аналогично, блокада синтезов белка и РНК в G 2 -периоде, перед митозом, приводила к его задержке или полной остановке. Т. о. , показано, что для инициации митоза необходимы: синтез белка – MPF, который происходит в G 2 -периоде за 10 -30 мин до митоза; синтез м. РНК для этого MPF – за 1 -2 ч до митоза; синтез р. РНК – за 2 -3 ч до митоза.

Т. о. , ингибиторный анализ показал, что: 1) индукторы SPF и MPF вырабатываются самой клеткой, это собственные, внутриклеточные регуляторы митотического цикла; 2) это белки, а значит – продукты определенных генов – регуляторов цикла; 3) активация и экспрессия регуляторных генов цикла происходит непосредственно перед началом контролируемого процесса – S-фазы или митоза. NB: Начало S-периода и запуск митоза – две важнейшие контрольные точки (check points), имеющие генетическое управление. Существуют ли другие контрольные точки и контролирующие их гены? Существует ли «система домино» , управляющая клеточным циклом?

2. 3. Генетические доказательства генной регуляции цикла. Генное семейство Сdc Лучшее доказательство генной регуляции того или иного процесса (или структуры) – найти в природе мутации этого процесса (структуры). У различных эукариот обнаружены циклоспецифические мутанты. Дрожжи. На дрожжах началось систематическое изучение генетики размножения клеток. Большой вклад внесли исследования лаборатории Hartwell’а (1968 – 1978, 1995 гг. ). Дрожжи имеют продолжительную гаплоидную стадию в жизненном цикле (связано с мейозом, образованием спор), что способствует выявлению рецессивных мутаций. У дрожжей выявлено около 50 фенотипических мутаций по дефектам клеточного (митотического) цикла. Это значит, что не менее 50 генов управляют циклом. Это семейство генов обозначено как гены cdc – cell division cycle.

В делении дрожжей различимы 3 относительно независимых цикла (как и у других эукариот), и каждый из них имеет несколько мутаций (значит, управляется несколькими генами). Ниже показаны только некоторые из них. Стартовую точку и следующий митоз запускает ген cdc 28 (у почкующихся дрожжей) или его гомолог cdc 2 (у делящихся дрожжей). Синтез ДНК инициирует ген cdc 8 (в хромосомном цикле). Репродукция центриолей (у дрожжей – внутриядерные ЦОМТы) зависит от гена cdc 31 (в центросомном цикле). При подготовке деления (почкования) ядра активен cdc 24, телофазу и цитокинез контролирует cdc 15 (в цитокинетическом цикле) и т. д. .

Клетки млекопитающих. В различных клеточных культурах выявлены циклоспецифические мутации, гомологичные cdc-мутациям дрожжей. При нормальной температуре (37°) клетки делятся нормально. Но при пониженной (34°) или повышенной (39°) температуре клетки останавливаются в той или иной стадии цикла: возможны блок цитокинеза, блок анафазы, блок распада ядерной оболочки, блок перехода G 1/S и другие. Значит, все эти процессы контролируются определенными генами. Известно более 30 циклоспецифических мутантных (температурочувствительных) линий клеток млекопитающих. Всего, включая протоонкогены, определено более 100 генов, управляющих клеточным (митотическим) циклом.

3. Гены компетентности к циклу (раннего ответа) Гены myc, fos, myb и др. Это ключевые гены пролиферации. Под действием внешних факторов роста и гормонов (см. ниже), через соответствующие цитоплазматические мессенджеры, эти гены активируются и экспрессируют белки Myc, Fos, Myb, которые активируют клетку к переходу G 0/G 1. Клетка становится компетентной (способной) к митотическому циклу. Т. о. , гены компетентности работают в раннем пререпликативном периоде. Соответствующие, белки Myc, Fos, Myb после синтеза поступают из цитоплазмы (с рибосом) в ядро, где взаимодействуют с хроматином и ядерным матриксом. NB: англоязычные навания генов и белков принято писать по-разному: гены – со строчной буквы курсивом (myc, fos, myb, cdc 8, cyclin D); белки – с прописной буквы прямым шрифтом (Myc, Fos, Myb, Cyclin D), а для многословных названий – аббревиатурой (семейство киназ CDK, киназы Cdk 1, Cdk 2 …). Безымянные белки обозначают строчной буквой «p» (protein) и массой в k. D (p 21, p 34, p 53 …)

• В частности: • Семейство генов myc – кодирует белки, ядерные фосфопротеиды (ок. 65 к. Д), способные связываться с точками «origin» ДНК и соединять их с ядерным матриксом для подготовки ДНК к репликации. Транскрипция этих генов резко активируется (в 20 -30 раз!) через 1 ч после стимуляции (из G 0 -состояния), достигает пика через 3 ч и вскоре снижается, задолго до начала S-периода. (В опыте, под действием колоние-стимулирующего фактора (КСФ) происходит быстрая экспрессия генов myc с угнетением ц. АМФ. Это условие для выхода из G 0 в цикл или дифференцировку). • Ген fos продуцирует белок – тоже ядерный фосфопротеид (55 к. Д), который еще раньше (через 15 -20 мин после стимуляции) связывается с ДНК и активирует гены типа myc, продукты которых необходимы для запуска предстоящей репликации.

• Т. о. , работает каскад: ФР → Рецептор → Мессенджеры → fos →Fos → myc → Myc … → Origin ДНК + матрикс. Действие генов fos и myc кратковременно, это гены раннего пререпликативного периода (раннего ответа), факторы приобретения клеткой митотической компетентности. • Далее, в клеточном ядре белки этого каскада принимают участие в активации генов отложенного ответа – ранних G 1 -киназ и циклинов, ответственных за переход из G 1 в S-период (см. ниже). NB: Ранний ответ генов fos, myc и др. соответствует первому пику транскрипции в реакции плейотипического ответа покоящихся клеток (см. выше о периоде покоя). NB: Действие генов myc и fos, т. е. белков Myc и Fos, кроме прочего, направлено на инактивацию и разрушение белка покоя р27. Но об этом ниже.

4. Гены прогрессии цикла. Циклины и циклинзависимые киназы • Для других генов – регуляторов митотического цикла установлено время активности по ходу самого цикла. Мутации этих генов останавливают соответствующие стадии цикла. Это гены двух больших семейств – cdc (cell division cycle) и cyclin. • Открытие генов семейства cdc связано с изучением циклоспецифических мутантов дрожжей и культур клеток млекопитающих (см. выше). Позже эти работы были сопоставлены с открытием белкового фактора MPF в процессах созревания ооцитов и дробления зиготы лягушки. • Это интересная и драматичная история в изучении проблем репродукции и дифференцировки клеток.

В 1971 г. у лягушки выявлен MPF (maturation/mitotic promotion factor), запускающий в ооцитах деления созревания (мейоз), а также и митозы первых делений дробления. В ооцитах MPF появлялся под действием гормонального сигнала (прогестерона), так что это типичный эндогенный регулятор, вырабатываемый самими ооцитами. В дробящихся бластомерах активность MPF пульсирует: он появляется в митозе и исчезает в интерфазе. При этом клетка совершает ритмические сокращения, не зависящие от активности ядра. Сокращения сохранялись при блокировании митоза, блокировании веретена, даже при удалении ядра. Стало ясно, что в цитоплазме ооцита, зиготы, бластомеров работает автономный осциллятор, колебательный цикл химических реакций веществ, накопленных заранее (запас MPF или его м. РНК).

Так сформировались два конкурирующих (казалось – взаимоисключающих) представления о механизмах регуляции цикла: • Механизм генного «домино» , представляющий конвейер генетических активностей семейства cdc, в котором каждый отработавший ген включает следующий ген митотического цикла (на основе работ с мутантными по циклу дрожжами и клеточными культурами). • Механизм цитоплазматического осциллятора ( «часовой механизм» ), который заложен заранее и периодически включает весь комплекс биохимических и структурных реакций митоза (на основе работ с ооцитами лягушки и морских ежей). Вскоре состоялся неожиданный синтез этих двух идей.

• В 1980 -х годах была установлена идентичность белков, инициирующих митоз в этих двух моделях: (1) белка-продукта гена cdc-2, запускающего митоз у дрожжей, и (2) одной из субъединиц MPF лягушки – белка p 34, а также аналогичных белков и генов у других животных, включая человека. • Это оказалась одна и та же протеинкиназа – p 34 cdc-2 – фермент, фосфорилирующий (при расщеплении АТФ) разнообразные белки, участвующие в организации и течении митоза (см. ниже). [Этим «золотым гвоздем» соединились две линии исследований, две, казалось, альтернативные теории регуляции митотического цикла. ] • Вторая субъединица MPF была определена как белок-активатор киназы и названа Cyclin B (циклин Б). То есть, киназа p 34 работает только в связке с циклином Б (гетеродимерная форма белка). Поэтому безымянный до тех пор фермент класса протеинкиназ - p 34 - получил имя – Cdk 1 (cyclin dependent kinaze 1 – циклин-зависимая киназа 1). Cdk 1 + Cyclin B = Cdk 1/Cyclin B Неактивные формы киназы и циклина = Активная димерная форма

В первой половине митоза (профаза-метафаза) киназа Cdk 1 под контролем циклина Cyc. B работает, а уже в анафазе циклин разрушается и киназа теряет свою активность. В течение следующей интерфазы циклин синтезируется заново. Перед митозом он соединяется со своей киназой Cdk 1, активирует ее для запуска нового митоза и в анафазе разрушается. В следующем цикле циклин синтезируется заново. Т. о. , активность Cdk 1 циклически изменяется вслед за изменением концентрации циклина. Отсюда и название киназы: Cdk– cyclin-dependent kinaze – циклин-зависимая киназа.

• Так изменяется концентрация белков в клетке: Cdk 1 (постоянная) и Cyclin B (переменная) – в ходе митотических циклов. • NB: Разрушение циклина обязательно для нормального завершения текущего митоза и начала следующего цикла. • Что же делает MPF = Cdk 1/Cyclin B как триггер митоза? Какие функции выполняет протеинкиназа Cdk 1, активируемая циклином В?

• Функции (активности) протеинкиназы Cdk 1 в организации митоза: 1) фосфорилирует ламины ядерной оболочки и, тем самым, инициирует ее распад; 2) фосфорилирует белки конденсины и гистон Н 1, способствуя конденсации хромосом; 3) фосфорилирует центросомный белок р225, способствуя сборке веретена; 4) активирует APC (anaphase promoting complex) – ферментная система, которая - разрушает белок когезин хромосомных связок, делая возможным расхождение сестринских хроматид, - запускает протеолитическую деградацию собственного циклина В (убиквитинация и расщепление ферментами протеасом). • Т. о. , протеинкиназа Cdk 1, активированная циклином В, после выполнения работы по запуску митоза сама же инициирует распад своего циклина и становится неактивной. Эта реакция обеспечивает кратковременность действия MPF. • Так был расшифрован митотический осциллятор – MPF.

• Но, как и следовало ожидать, вскоре были открыты и другие осцилляторы, стимулирующие переходы G 1/S (SPF), S/G 2 и всю прогрессию интерфазы. • Это тоже протеинкиназы, белки-ферменты семейства CDK (2, 4, 6…) – продукты генов cdc, активируемые своими циклинами (A, C, D, E…). Особенно важен SPF – комплекс Cdk 2/Cyclin E, обеспечивающий переход G 1/S. Его функция – фосфорилирование регуляторного белка p. Rb (открыт как супрессор опухоли ретинобластомы, но оказался универсальным супрессором любого митотического цикла в точке перехода G 1/S). В активной (дефосфорилированной) форме p. Rb блокирует фактор транскрипции E 2 F, необходимый для синтеза белков, запускающих и поддерживающих репликацию ДНК. Т. о. , фосфорилирование p. Rb с помощью киназы Cdk 2 освобождает и активирует фактор транскрипции E 2 F, разрешая начало синтеза ДНК. • Транскрипционный фактор E 2 F поддерживает также синтез самого циклина Е, обеспечивая поддержку репликации по всему S-периоду.

• Эти и другие комплексы Cdk/Cyclin и время их активации показаны ниже.

• NB: В раннем эмбриогенезе (дробление зиготы, бластула) работают в чистом виде только 2 осциллятора: Cdk 1/Cyc. B (MPF) и Cdk 2/Cyc. E (SPF). Работают независимо от ядра, без транскрипции, так как они (или их и. РНК) накоплены в цитоплазме в периоде роста ооцита, как и многие другие регуляторы раннего эмбриогенеза. Это простейший митотический цикл – без G 1 -периода, часто и без G 2. • В соматических клетках, начиная с гаструлы, включается морфогенетическая (транскрипционная) функция ядер, начинает работать вся система генетического контроля цикла. У млекопитающих, по разным данным, это 7 -12 видов Cdk и 9 -14 видов циклинов. При этом одна киназа может работать с несколькими циклинами и наоборот, так что регуляторный пул очень велик и многообразен. Цикл удлиняется, появляются G 1 - и G 0 -периоды, необходимые для исправления возникающих мутаций и ошибок репликации, а также для ожидания сигналов к дифференцировке.

5. Система контрольных точек и ингибиторы митотического цикла • Т. о. , события митотического цикла представляют взаимосвязанную цепь шагов: репликация ДНК, удвоение центросом и формирование веретена, разрушение ядерной оболочки, компактизация и разделение хромосом, цитокинез … • При этом в нормальном цикле нарушение одной стадии обычно приводит к задержке следующих стадий, хотя далее возможно продолжение цикла с перескоком через стадию. Например, если в температурочувствительных (ts) мутантах по ДНКполимеразе остановлена репликация ДНК, то и митоз, и цитокинез останавливаются. • Почему в этих условиях не активируется Cdk 1/Cyclin. B, не собирается веретено, не расходятся хромосомы? • В начале 1990 -х годов выдвинута гипотеза (Хартвел и др. , 1989 -92), которая объясняло этот феномен.

Гипотеза Хартвела: • В клетке существует контрольный механизм – система надзора за митотическим циклом. Должны быть специальные ингибиторы митотических киназ – CKI (cyclin kinaze inhibitor), которые останавливают цикл, если предыдущий шаг не пройден. • Это система контрольных точек (check point) – короткие остановки на переходных стадиях цикла, в которых клетка с помощью специальных молекулярных сенсоров оценивает состояние своих структур, ферментов, ДНК на их готовность к дальнейшим шагам по циклу. Если обнаруживаются нарушения, вырабатывается негативный сигнал и цикл приостанавливается. • Число контрольных точек, по-видимому, равно числу промоторов Cdk/Cyclin. Сначала (дробление зиготы) активны 2 из них – для SPF и MPF. Позже (гаструляция) включаются остальные (у Xenopus от стадии 800 -клеточного зародыша). Включение контрольных точек и есть реальная причина замедления циклов, появления G 0 -, G 1 -, G 2 задержек.

• Наиболее важен и сложен р53 -р21/Waf 1 -p. Rb–зависимый путь (опухолевой супрессии), который останавливает клетки на границе G 2/M и G 1/S в случае нарушений репликации ДНК. • При неполной или неправильной репликации, при повреждениях ДНК (например радиацией) с помощью специальных сигнальных белков (р19 и др. ) активируется главный «сторож цикла» - белок р53 (фактор транскрипции), который активирует промотор и запускает ген для синтеза белка р21/Waf 1 из семейства INK 4 (от Inhibitor of Cdk). Этот р21 является универсальным ингибитором различных СD-киназ – подавляет активность Cdk 1 (=блок митоза) или Cdk 2, 4, 6 (=блок G 1/S) до устранения разрывов и завершения репаративных синтезов ДНК. Если ДНК не репарируется, р53 при достижении критической концентрации стимулирует синтез каспаз и запускает апоптоз. • Другой универсальный ингибитор CD-киназ – белок р27/Kip 1 – обеспечивает более стойкое и глубокое блокирование Cdk 2, 4, 6 и перевод клетки в период покоя G 0. Преодоление этого блока, разрушение р27, возможно с участием белков/генов компетентности Mycmyc, Fosfos… (см. выше) под влиянием факторов роста и гормонов (см. далее). • Прочие ингибиторы цикла (CKI): из семейства KIP – р57; из семейства INK 4 – р15, р16, р18, р19.

• NB: Транскрипционный фактор р53 участвует также в запуске синтезов м. РНК (и, соответственно, белков), направляющих клетку в дифференцировку. Так увязаны выход клеток из митотического цикла и начало их тканевой специализации.

• И еще одно важное NB: Все гены белков-стимуляторов и промоторов цикла (гены компетентности, гены cdc, производящие киназы семейства CDK, гены циклинов, гены соответствующих сигнальных путей и прочие) являются протоонкогенами. Их повышенная экспрессия, например, при случайной активации их промоторов или в результате привнесения их мутированных форм вирусами, превращает эти нормальные гены пролиферации в онкогены и ведет к постепенно нарастающему, избыточному, опухолевому росту ткани. • Соответственно, все гены белков-ингибиторов цикла (белков CKI, особенно р53 – сторож цикла, p. Rb и др. ) должны быть обозначены как антионкогены, в онкологии это опухолевые супрессоры. Однако их мутации, недостача, утрата в результате неправильного митоза – тоже путь к опухолевой трансформации клеток, причем гораздо более короткий и радикальный, чем накопление мутаций протоонкогенов. Достаточно одной р53 -дефицитной клетки, чтобы породить мутантный клеточный клон и быстро растущую раковую опухоль. • Но это отдельная большая тема, можно сказать, специальная медикобиологическая наука – онкобиология. Ее изучение за пределами нашего спецкурса.

6. Факторы роста Сколько бы генов не было задействовано в обеспечении цикла данной клетки, их регуляция идет извне. Исторически идея стимуляции митозов развивалась через ряд теорий. 1. Теория митогенетических лучей (полей), испускаемых яйцеклеткой, зиготой, зародышем (Гурвич, 1930 -е годы). 2. Теория некрогормонов (1950 -е годы), согласно которой поврежденные клетки освобождают активные митогенные вещества – стимуляторы пролиферации (некрогормоны, раневые гормоны). Это – продукты распада белков или НК. 3. Современное представление о «факторах роста» , которые совместно с гормонами управляют размножением и дифференцировкой клеток. Сегодня этой системе отводится центральная роль в организации роста и морфогенезов.

• Действие ФР в чистом виде можно изучать на клеточных культурах in vitro, так как в организме (in vivo) это действие опосредовано и скооперировано со всей системой регуляции. • Давно известно, что для роста клеточных культур в искусственную питательную среду необходимо добавлять 5 -10% сыворотки крови, лучше фетальной (эмбриональной, плодной). В ней содержатся различные биогенные стимуляторы, которые и были названы факторами роста. Для растительных культур это – соответствующие гормоны роста (ауксины и др. ). Без этих факторов клетки не размножаются, переходят в G 0 -, реже в G 2 -период.

6. 1. Общие свойства и механизм действия факторов роста (ФР-GF) 1) ФР синтезируются в разных органах и тканях, многие в клетках крови – как правило вне регулируемой клеточной популяции (вне клеточной мишени). 2) ФР распространяются через кровь (эндокринные ФР) или диффузно через межклеточные жидкости (паракринные, местные). Некоторые паракринные ФР могут быть автокринными – секретируются, но регулируют функции самой клетки-производительницы. Известны также юкстакринные факторы – сигнальные молекулы в форме интегральных белков плазмалеммы (не секретируются, действуют контактно на рецепторы соседних клеток).

3) ФР присутствуют в ткани и работают в очень малых концентрациях – 10 -9 – 10 -11 М. 4) ФР действуют, как правило, на несколько функционально связанных типов клеток – относительно тканеспецифично. 5) ФР – это несколько семейств полипептидов, многие с тремя -S-S-связями (6 остатков цистеина) (гомология в пределах семейства). 6) ФР действуют на клетку-мишень, как и пептидные гормоны – через рецепторы плазмалеммы. Внутриклеточный сигналинг осуществляется обычно с участием каскадов вторичных мессенджеров. Цитоплазматический домен рецептора (эффектор) может быть различным и комплексным: - тирозинкиназа – фосфорилирует сигнальные белки мессенджены по тирозину (факторы FGF, EGF, IGF и др. ); - серин-треонинкиназа – по серину и треонину (TGF-β); - диацилглицеролкиназа, фосфолипаза С и другие (разные ФР).

7) Цитоплазматический сигналинг от рецепторов к ядру происходит с участием актиновых микрофиламентов цитоскелета (выявлены прямые контакты рецепторов с актином, быстрая реорганизация микрофиламентов, в т. ч. стресс-фибрилл, при контакте рецептора с ФР). • NB: Рецепторы локализованы на фокальных контактах клетки с внеклеточным матриксом, здесь же вход сигнала. Распластанные (фиксированные) клетки чувствительны к ФР. 8) Конечное действие мессенджеров – на хромосомы: активация транскрипционных факторов (ТФ) для генов компетентности (myc, fos, myb), генов прогрессии цикла (cdc, cyclin) и других генов, управляющих циклом и дифференцировкой клеток.

Пример: система сигналинга при взаимодействии клетки с фибробластическим фактором роста (FGF). FGF-лиганд связывается со своим рецептором (известны 4 формы – FGF-рецепторов). Взаимодействуют 2 рецептора. Их цитоплазматические домены – тирозинкиназы – при возбуждении FGF-лигандом автофосфорилируются, после чего фосфорилируют белок-адаптор – один из элементов сигналингкаскада. Фосфо-белок-адаптор активирует G-белок RAS: RAS-GDP→RAS-GTP. Далее через цепочку MAP-киназ (RAF-MEK-ERK) фосфорилируется транскрипционный фактор. Теперь его активная фосфо-форма включает экспрессию нужного гена.

• Активированная рецепторная тирозинкиназа (RTK) стимулирует также фосфолипазу С, которая расщепляет фосфатидилинозитолдифосфат (PIP 2) на инозитолтрифосфат (IP 3) и диацилглицерол (DAG), что вед к изменению ионного состава цитоплазмы. • NB: Как правило, ФР регулируют не только репродукцию клеток, но и их дифференцировку, выступая не только стимуляторами митоза, но где-то и ингибиторами. Т. е. ФР в целом контролируют весь морфогенез.

6. 2. Разнообразие факторов роста Известны десятки семейств ФР (GF). Рассмотрим некоторые, наиболее изученные у млекопитающих животных и человека. 1. EGF – Epidermal Growth Factor; = ЭФР – Эпидермальные ФР. Полипептид из 53 аминокислот, включающий 6 остатков цистеина, т. е. 3 S-Sмостика. Сигналинг через тирозинкиназный эффектор, белок-адаптор и цепочку киназ (как показано выше). Основной источник: синтезируется и выделяется в кровь клетками протока подчелюстной слюнной железы (здесь же ФРН – фактор роста нервов). Мишени: деление эпидермоцитов, фибробластов дермы и др. клеток. Дополнительный источник: клетки стромы и теки яичника. Мишень: клетки гранулёзы фолликулов. Хороший пример взаимодействия эпителия и соединительной ткани. NB: ЭФР уже используется при выращивании in vitro кожных пластов для имплантации в заместительной терапии.

2. PDGF – Plate Dependent Growth Factor; = ТФР – Тромбоцитарные ФР. Разновидности из 2 цепей по 125 (А) и 160 (В) аминокислот: АА, АВ, ВВ. Источник: кровяные пластинки (тромбоциты). Мишени: стимулируют размножение гладкомышечных клеток поврежденных сосудов, а также фибробластов и нейроглии в очаге повреждения (и в культуре). NB: регулирует комплекс функционально связанных клеток. 3. FGF – Fibroblast Growth Factor; = ФРФ – Фибробластные ФР. Название возникло от первого обнаруженного фактора этого семейства, который стимулировал размножение культуры клеток фибробластов. Это – обширное семейство FGF-белков, синтезируемых с соответствующих генов fgf, насчитывающее много представителей (до 19 у млекопитающих) и сотни изоформ от альтернативного сплайсинга. Основные формы: FGF-1 – кислый, 140 аминокислот. FGF-2 – основный (щелочной), 146 аминокислот. Мишени: стимулируют размножение многих типов клеток, в основном из мезенхимного ряда: фибробластов, эндотелия, миобластов, мезенхимы, но также клеток тимуса, печени.

Примеры: FGF-2 играет важную роль при формировании кровеносных сосудов: • Секреторные клетки гипофиза → стимуляция эндотелия гипофиза. Более того, эндотелий in vitro, т. е. в отсутствие внешнего источника, синтезирует ФРФ сам для себя и транспортирует его в свои ядра, а избыток выделяет во внеклеточный матрикс. ) • FGF-7 – фактор роста (размножения) кератиноцитов. • Клетки гранулёзы фолликула → стимуляция эндотелия жёлтого тела. (Но способен активировать и саму гранулёзу (автокринная регуляция).

4. SDGF-1 – Spleen Dependent Growth Factor; = ФР из селезенки. Гомологичен с ФРФ. Источник: клетки селезенки. Мишени: стимулирует пролиферацию гепатоцитов, фибробластов, эндотелия. В целом стимулирует рост печени. 5. IGF-I, IGF-II – Insulin-like Growth Factor; = ИФР – Инсулиноподобный ФР. 2 основные формы – 70 и 73 аминокислот. Действует совместно с ТФР и ЭФР. Стимулирует размножение соединительно-тканных и жировых клеток. 6. Остеопоэтин. Из клеток красного костного мозга. Стимулирует пролиферацию остеобластов.

7. Гемопоэтические ФР. Эритропоэтин. Источник: юкстагломерулярные клетки почек. Мишень: эритробласты (эритропоэз). Гранулоцитопоэтин. Источник: строма костного мозга. Мишень: миелоидные бласты (миелопоэз). Тимопоэтин. Источник: строма тимуса. Мишень: лимфобласты в тимусе. Интерлейкины (цитокины) и лимфокины (колониестимулирующие факторы). Участвуют в реакциях клеточного иммунитета, стимулируют размножение и дифференцировку лимфоцитов. 8. TGF-α – Transforming Growth Factor-α; = ТФР-α – Трансформирующий ФР-α. 30% гомологии с ЭФР, содержит 6 остатков цистеина. Взаимодействует с теми же рецепторами. Выделен из раковых опухолей (т. е. из трансформированных клеток). Но работает и в нормальном эмбриональном развитии: в клетках плаценты, печени (стимулирует овальные стволовые клетки печени). Т. е. , TGF-α – нормальный ФР раннего развития и регенерации. В опухолях активируется вторично.

9. TGF-β – Transforming Growth Factor-β; = ТФР-β – Трансформирующий ФР-β. Большое семейство ФР. По свойствам близки к настоящим гормонам (оказывают двойной эффект). Усиливают или подавляют (для разных клеток по-разному) реакцию на другие ростовые факторы, регулирует дифференцировку многих клеток. В эмбриогенезе контролируют не только репродукцию, но также апоптоз и миграцию клеток, дифференциацию мезодермы, нейронов, кишки. Примеры: - активирует рост ранне-эмбриональных фибробластов, но в позднеэмбриональных фибробластах и многих эпителиях ингибирует G 0 -G 1 переход и способствует их дифференцировке; - в фолликулах яичника ТФР-β синтезируется клетками теки и ингибирует пролиферацию клеток гранулёзы, одновременно усиливая ее чувствительность к ФСГ и способствует дифференцировке в желтое тело (паракринный механизм регуляции).

10. SDGF – Shwannomous Dependent Growth Factor – ФР из шванномы. Еще один пример гормоноподобного (двойственного) действия ФР. Является митогеном (стимулятором размножения) нейроглии и фибробластов оболочек нервов. Но одновременно индуцирует дифференцировку нейронов и образование их аксонов (индуцирует синтез м. РНК и специальных белков для роста аксонов). ………………… • В целом, факторы роста в разных условиях, концентрациях и комбинациях могут работать и как стимуляторы, и как ингибиторы пролиферации, управляя ростом и специализацией зачатков, тканей, органов. • Тканеспецифичность факторов роста тоже относительна, как и у гормонов. Клетки реагируют, как правило, не на один ФР, а на специфическую комбинацию ФР и гормонов. • Разнообразие ФР не так велико, но комбинаций очень много – на разные типы клеточной спецификации (дифференцировки).

6. 3. Факторы роста препятствуют старению и гибели клеток Для многих клеток в культуре установлен «лимит Хэйфлика» (Hayflick, 1965) – ограничение на максимальное число делений, после которого культура отмирает (= репликативное старение клеток). • Фибробласты от плода человека переживают до 50 пассажей, т. е. удвоений популяции; • Фибробласты от 40 -летнего человека – до 40 пассажей; • Фибробласты от 80 -летнего человека – до 30 пассажей. (NB: потенциальный возраст истощения соединительных тканей человека – 200 лет). Оказалось, что старение клеток и отмирание культуры ускоряется при недостатке ФР и, наоборот, замедляется при их избытке. Примеры:

• Культура эпидермиса ребенка на обычной среде с сывороткой дает 50 циклов удвоения, но в присутствии избытка ЭФР – 150 циклов. • «Бессмертные» клетки перевиваемой линии 3 Т 3 при недостатке в среде факторов роста все же проявляют признаки старения. (ФР поддерживают активность теломеразных генов? ) • Клетки эмбриона мыши на обычной среде с сывороткой тоже дают ограниченное число поколений, а в присутствии очищенных ФР (вместо сыворотки) растут без признаков старения. Но при добавлении сыворотки рост останавливается. Т. о. , старение клеточной популяции (частично) обусловлено какимито компонентами сыворотки, которые перевешивают действие ростовых факторов. • Фибробласты от больных синдромом Вернера (преждевременное старении в 40 -50 лет, наследуемое) быстро стареют в культуре (дают мало циклов удвоения). Они оказались не чувствительны к ТФР (PDGF) и ФРФ (FGF) – мутация с утратой рецепторов?

Т. о. , с факторами роста могут быть связаны причины старения тканей, органов и организмов (наряду с другими): 1) утрата клетками рецепторов к ФР (мутации); 2) снижение выработки ФР; 3) снижение выработки гормонов, управляющих синтезом ФР (эндокринное старение).

7. Гормоны и пролиферация клеток В отличие от факторов роста настоящие гормоны – продукты эндокринных желез. Биохимически различаются три группы гормонов: • моноамины, • стероиды, • пептиды. Роль гормонов состоит в регуляции роста, развития и функционирования органов и тканей, включая регуляцию клеточного размножения и дифференцировки.

7. 1. Моноамины Моноаминовые гормоны образуются из аминокислот путем небольшой перестройки. Это – неспецифические регуляторы роста и дифференцировки клеток разных тканей. Тирозин → норадреналин, адреналин (катехоламины мозгового вещества надпочечников), тироксин (гормон щитовидной железы). • Норадреналин – стимулятор, сокращает клеточный цикл в различных тканях. • Адреналин – действует на другие рецепторы и подавляет клеточное размножение, работает как универсальный ингибитор пролиферации. При этом запускает в организме комплексную стрессовую реакцию.

Согласно теории кейлонов – тканеспецифичных ингибиторов пролиферации, выделяемых зрелыми клетками против своего же камбия, адреналин является «орудием» в действии кейлонов. Кейлон обеспечивает тканеспецифич-ность реакции, а адреналин – ингибирование. На основе тирозина образуются также ингибиторы у гидроидов: гомарин и тригонеллин. Это нейросекреты нейронов головы и подошвы гидры. Задерживают метаморфоз, регенерацию головы и столона. В межклеточном веществе создают градиенты вместе с пептидными активаторами.

• Триптофан → серотонин, триптамин и др. (индольные производные). Это неспецифические факторы эмбрионального развития разных животных, стимуляторы регенерации планарии, моллюсков, печени млекопитающих и в других случаях. (Например, серотонинэргические нейроны активны в личиночном нейрогенезе у моллюсков, а также резко активируются при регенерации нервов и ганглиев ЦНС. ) • Прочие моноамины, образуемые из пищевых аминокислот: гистамин, путресцин, спермидин – ткане- и видонеспецифические стимуляторы пролиферации. • NB: У всех моноаминов очень слабая (или вообще отсутствует) видовая и тканевая специфичность. Содержание путресцина, спермина и спермидина повышено в любых растущих тканях: плаценте, регенерирующей печени, опухолях и др. Это отражает их давнее происхождение! Моноамины – древнейшие и простейшие регуляторы клеточного размножения и роста. Имеются уже у цианобактерий.

Образование более сложных гормонов шло посредством реакций поликонденсации – в направлении стероидов и полипептидов. 7. 2. Стероидные гормоны Реакция поликонденсации: терпены → стероиды: Терпен (С 5 Н 8)2 – димер углеводорода изопрена ↓ Сесквитерпены (С 5 Н 8)3 → Фарнезол → Ювенильный гормон членистых (стимулирует размножение клеток и рост, препятствует линьке). ↓ Дитерпены (С 5 Н 8)4 ↓ Тритерпены (С 5 Н 8)6 → (циклизация) → циклопентанопергидрофенантрен → холестерин → разнообразные стероидные гормоны. (Перестройки за счет кетонирования (=О), окисления (-ОН), метилирования (-СН 3), ацетилирования и других радикалов, а также двойных связей в кольцах). • Экдизон – гормон линьки у Ecdysozoa (нематоды, приапулиды, членистоногие). Антагонист ювенильного гормона, а значит, ингибитор пролиферации.

• Кортикостероиды – гормоны коры надпочечников позвоночных. Функционально различаются: глюкокортикоиды (кортикостерон, кортизон, гидрокортизон), минералкортикоиды (альдостерон и др. ). Характерен двойственный эффект (±) в зависимости от дополнительных факторов. Например, гидрокортизон в чистом виде (без сыворотки) усиливает действие EGF на клетки He. La (способствует связыванию ФР с клеточными рецепторами), но в присутствии сыворотки (т. е. в сумме с другими ФР) ингибирует размножение тех же клеток. Тот же гидрокортизон на фибробластах 3 Т 3 усиливает действие EGF (работает как синергист ФР), но ингибирует действие FGF (антагонист ФР). Дексаметазон вместе с сывороткой стимулирует миобласты, но ингибирует фибробласты. • Половые гормоны. Мужские половые гормоны семенников (частично коры надпочечников, яичников): тестостерон, андростерон и др. Женские гормоны яичников (частично семенников, коры надпочечников): прогестерон, эстрадиол, эстрон и др. Кроме прочего, стимулируют мейоз – запускают сигнальный путь на синтез MPF.

• Механизм действия стероидов отличается от действия других гормонов. Они проникают сквозь плазмалемму и находят свой рецептор в цитоплазме, далее проникают в ядро и становятся организаторами транскрипции для соответствующих групп генов. NB: Стероидные гормоны в целом более видо- и тканеспецифичны, чем моноамины, но все же их специфичность ограничена. Все они эволюционно консервативны.

7. 3. Пептидные гормоны Имеются уже у низших многоклеточных. • ПМГ – пептидный морфоген гидры – нейропептид из 11 аминокислот. Секретируется нейронами «головы» и стимулирует деление стволовых (i) клеток, которые дают в первую очередь новые нейроны, потом эпителий (ПМГ – активатор головы). Вместе с активатором подошвы, а также моноаминовыми ингибиторами (см. выше) создает морфогенетические градиенты (поля) вдоль тела гидры, направляющие векторный рост и регенерацию: от подошвы растет голова, от головы – подошва. • NB: ПМГ еще малоспецифичен, его гомологи есть у других животных. ПМГ активен даже в отношении клеток млекопитающих. Используется в медицине для стимуляции роста легочного, кожного и других эпителиев.

У позвоночных полипептидные гормоны очень разнообразны, более ткане- и видоспецифичные. Хорошо выражена иерархия источников: • - Нейропептиды гипоталамуса (рилизингпептиды): соматолиберин, кортиколиберин, тиролиберин и др. либерины (всего 7); соматостатин и др. статины (всего 3). • - Тропные гормоны аденогипофиза (передней доли гипофиза): соматотропин (СТГ), кортикотропин (АКТГ), тиреотропин (ТТГ), гонадотропины (ФСГ, ЛГ), пролактин и др. • - Гормоны периферических эндокринных желез – большей частью моноамины и стероиды. Среди пептидных гормонов малоспецифичные инсулин, кальцитонин (паратгормон) – вовлечены в регуляцию размножения клеток в красном костном мозге, тимусе, печени и др.

7. 4. Комплексное действие гормонов и других регуляторов Важно то, что один и тот же тип клеток регулируется группой факторов разной сложности и специфичности, например: СТИМУЛЯЦИЯ ИНГИБИРОВАНИЕ Путресцин Кортизол Инсулин Несколько ФР (FGF, EGF, PDGF …) И др. Дексаметазон ФИБРОБЛАСТЫ Кортизол Интерферон Тканеспецифичные пептиды-ингибиторы CD-киназ, кейлоны И др.

При этом сами регуляторы встроены в сложные иерархические цепи (сети) управления с возможностью изменения уровня активности. Например, сеть управления через СТГ (соматотропный гормон) включает: ГИПОТАЛАМУС ЭПИФИЗ ↓ ↓ рилизинг-пептиды ↓ ↓соматолиберин – (стимуляция) → (+) ГИПОФИЗ (+) ← серотонин – (стимуляция) соматостатин – (угнетение) →→→ (–) ↓ ↓ ↓ СТГ ТТГ АКТГ и др. ↓↓↓ Пролиферация гепатоцитов, энтероцитов и др. Стимулирует выделение печенью соматомедина - ускоряет рост костной и др. тканей. Стимулирует образование в тканях полиаминов – - неспецифическая стимуляция… Причем в сетях возможны каскадные реакции превращения неактивных форм регулятора в активные и наоборот, с участием разнообразных ферментов, например: кортизон → кортизол (= гораздо более сильный стимулятор); норадреналин → адреналин (= смена стимуляции на угнетение).

• Таким образом, гормоны включены в кооперативное действие всех регуляторов пролиферации и дифференцировки, в комбинации с несколькими факторами роста, специфическими и неспецифическими ингибиторами. Поэтому для гормонов, как и для некоторых факторов роста (см. выше) характерны двойственные (стимулятор-ингибитор) эффекты. • Система экзогенной регуляции пролиферативных процессов и дифференцировки клеток многоклеточных организмов усложнялась в ходе биологической эволюции. У высших животных клеточная пролиферация в тканях регулируется сочетанием филогенетически древних факторов – видо- и тканенеспецифических (амины, стероиды) и более молодых – специфичных (полипептидные гормоны и факторы роста). При этом действие древних неспецифических факторов становилось подчиненным, они использовались как усилители сигналов от новых, более ткане- и видоспецифичных регуляторов. Т. е. специфические регуляторы (полипептидные гормоны и ФР) в ходе эволюции дополняли систему регуляции, которая изначально (у одноклеточных) была довольно примитивной – неспецифической. Появлялись и соответствующие наборы клеточных рецепторов, усложнялись межклеточные и межтканевые взаимодействия.

Заключение В целом получается такая система регуляции клеточного размножения. 1) Клетка генетически запрограммирована на пролиферацию. Синтез белков – стимуляторов клеточного цикла (Cdk) идет постоянно, и вместе с соответствующими циклинами они задают график течения цикла. Главные из них (и минимально достаточные) – белки SPF (Cdk 2/Cyclin E) и MPF (Cdk 1/Cyclin B). 2) Но в клетке есть и гены негативного контроля цикла, экспрессирующие белки-ингибиторы циклинзависимых киназ (CKI): p 19, p 21, p 27, …p 53, p 57, p. Rb, а также TGF β, интерферон и другие ингибиторы. В G 1 -периоде каждого очередного цикла (в точке r, check point) эти белки подавляют гены подготовки нового синтеза ДНК (cdk 6, 4, 2, cyclin D, E) и направляют клетку в период покоя G 0.

3) У одноклеточных переход через точку r в новый цикл регулируется наличием или отсутствием пищи, феромонов и других активаторов цикла. У первых многоклеточных экзогенные индукторы – моноамины, стероиды, олигопептиды – дополнили систему регуляции, и далее она усложнялась с участием нейросекреторных, эндокринных (гормоны) и паракринных (факторы роста) полипептидов. Факторы роста через рецепторы и внутриклеточные мессенджеры активируют транскрипционные факторы (ТФ) генов компетентности (myc, fos, myb и др. ); экспрессируемые этими генами белки блокируют белки-ингибиторы (прежде всего p 27), изменяют структуру хроматина и выводят клетку из состояния покоя G 0.

4) Другие факторы роста аналогичными путями повышают экспрессию генов прогрессии цикла (сdk/cyclin); продуцируемые белки семейств Cdk и Cyclin обеспечивают продвижение клетки по циклу: G 1 -S-G 2 -M, до нового G 0 -периода (позитивный контроль цикла). Негативный контроль с помощью белков CKI создает паузы для исправления ошибок репликации. 5) Гормоны и пептидные ингибиторы модифицируют (подавляют или усиливают) действие факторов роста, регулируя переходы к дифференцировке клеток и апоптозу. Т. о. , у высших многоклеточных животных, с их сложной органнотканевой структурой, в экзогенной регуляции клеточного размножения факторы роста специализируют действие гормонов и других неспецифических регуляторов. Центральная нервная система (через гипоталамус) и факторы внешней среды выступают как еще более удаленные эпигенетические регуляторы роста и развития.