Тема 22. «Генетическая инженерия, плазмиды» 1. Плазмиды бактериальных клеток 2. Системы рестрикции и модификации бактериальной клетки 3. Генная инженерия, клонирование генов в клетках микроорганизмов 4. Успехи и проблемы биотехнологии
Вопросы 1. Плазмиды бактериальных клеток
• Теломеразы – ферменты, участвующие в замыкании теломероподобных концов линейных молекул ДНК плазмид.
F-плазмида бактерий E. coli Примечание: *п. н. – пара нуклеотидов; **Да (Д) – молекулярная масса молекулы химического соединения, выраженная в дальтонах. Дальтон – единица молекулярной массы, равная массе атома водорода. -Молекулярная масса самой мелкой плазмиды = 1, 5 МД ( E. coli). -Молекулярная масса наиболее крупных плазмид равна 500 МД (отдельные виды рода Pseudomonas).
Свойства плазмид 1. Способность к автономной репликации. (Различают плазмиды со строгим и ослабленным контролем репликации). 2. Трансмиссивность (различают трансмиссивные (конъюгативные) и нетрасмиссивные (неконъюгативные) плазмиды. 3. Способность многих плазмид к интеграции в бактериальную хромосому. (Такие плазмиды называются эписомы). 4. Несовместимость. 5. Поверхностное исключение – присуще только конъюгативным плазмидам. 6. Плазмиды детерминируют различные фенотипические признаки бактерий.
Термины и определения • • ДНК-полимераза III ДНК-полимераза I Мультикопийные плазмиды Космополитные плазмиды (RP 4) (Pseudomonas – Agrobacterium, Azotobacter, Erwinia, Rhizobium, Escherichia, Salmonella и др. ) Мобилизация Коинтеграты Доноры типа Hfr (High frequency recombination) Группа несовместимости F 1: F-типа, Col – типа, R-типа
Плазмиды придают клеткам различные фенотипические признаки Например 1. Устойчивость к антибиотикам, ионам тяжелых металлов, мутагенам ( R- плазмиды) *R- resistense 2. Способность вызывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина, толуола и других ксенобиотиков (D- плазмиды) *D- degradation 3. Способность синтезировать антибиотики, бактериоцины, пигменты, токсины, сероводород, поверхностные антигены , инсектициды 4. Способность использовать в качестве источника углерода различные углеводы и необычные аминокислоты. 5. Способность вызывать образование опухолей у растений (Tiплазмиды) 6. Способность конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий или иметь донорные свойства (F- плазмиды) *F-fertility 7. Способность осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК. Криптические плазмиды – их фенотипические свойства неизвестны.
Значение плазмид для клетки бактерий 1. Определяют ряд ее фенотипических свойств, позволяющих более гибко и быстро реагировать на изменение условий окружающей среды. 2. Плазмиды бактерий находят широкое применение при теоретических исследованиях и выполнении ряда практических задач: Широко применяются в генетической инженерии. С их помощью можно получить рекомбинантные молекулы ДНК, вероятность образования которых в природе крайне низка или возникновение их вообще невозможно. Играют значительную роль в эволюции бактерий. Представляют большую ценность как материал для исследования структуры и функционирования генетического аппарата бактериальной клетки. • • •
Вопросы 2. Системы рестрикции и модификации бактериальной клетки
История открытия системы рестрикции и модификации бактериальной клетки • Явление рестрикции и модификации было открыто в 1953 г. Г. Бертани и Дж. Вайглем.
Далее подробно исследовано в конце 1960 -х гг. В. Арбером. Он предложил модель «рестрикциимодификации» (система R-M). Это теория, которая объясняет механизм ограничения способности роста бактериофагов в бактерияххозяевах определенного штамма.
Согласно этой модели, работающая в клетках бактерий система R-M, образована двумя специфическими для определенного штамма микроорганизма ферментами – метилазами и рестриктазами. Эти ферменты узнают в ДНК одни и те же определенные короткие последовательности нуклеотидов – сайты. Метилаза, модифицируя определенные основания внутриклеточной ДНК, защищает ее от действия рестриктазы, узнающей ту же нуклеотидную последовательность.
• За открытие рестриктаз и их применение в молекулярной генетике В. Арбер, Х. Смит, Д. Натанс были в 1978 г. удостоены Нобелевской премии.
• Классический пример функционирования системы R-M рассматривается на примере бактериофага λ в различных штаммах кишечной палочки. • Рестрикция – это ограничение, оно указывает на то, что процесс расщепления ДНК под действием ферментов ограничен чужеродной молекулой, в первую очередь фаговой ДНК, в то время как ДНК клетки-хозяина не расщепляется благодаря наличию защитных механизмов. . • Рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) – ферменты, которые препятствуют поддержанию чужеродной ДНК в бактериальной клетке.
Метилазы – ферменты, которые признаны защищать собственную бактериальную ДНК от действия собственных клеточных рестриктаз в результате модификации. Модификация – это процесс пострепликативного изменения структуры ДНК. Наиболее распространенная модификация – это когда метилазы изменяют или модифицируют собственную ДНК путем метилирования или гликозилирования аденина либо цитозина.
Названия рестриктаз Рестриктазы обозначаются буквой R - например, RBsu, REco • Название рестриктаз определяется родовым и видовым названием бактерии, из которого был выделен фермент. Дополнительное числовое обозначение (римская цифра) отражает хронологию открытия фермента: Bacillus subtilis – Bsu, Escherichia coli – Eco • Различают три типа рестриктаз: I, III.
Типы рестриктаз в зависимости от потребности в кофакторах и характера расщепления нуклеотидных последовательностей ДНК Рестриктазы I типа являются • Сложными белками с тремя различными типами субъединиц: 1) эндонуклеаза, 2) метилаза, 3) фермент узнавания. • Бифункциональны, т. е. выполняют функции разрезания и метилирования. • Для действия этих ферментов в качестве кофакторов требуются АТФ, АМФ, ионы Mg. Расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТФ. • Узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов). В результате образуются самые разнообразные фрагменты ДНК или рестрикты. • Рестриктазы I типа не находят применения для решения генноинженерных задач.
Типы рестриктаз в зависимости от потребности в кофакторах и характера расщепления нуклеотидных последовательностей ДНК (продолжение) • Рестриктазы III типа – имеют сходство с • • • рестриктазами I типа: Фермент состоит из двух различных субъединиц (эндонуклеаза, метилаза). Фермент – бифункционален, т. е. обладает как рестриктазной, так и метилазной активностью. Для действия этих ферментов в качестве кофакторов требуются АТФ ионы Mg. Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТФ. Расщепляют ДНК на расстоянии 20 -39 п. н. от сайтов узнавания. Довольно редко используются для практических целей.
Типы рестриктаз в зависимости от потребности в кофакторах и характера расщепления нуклеотидных последовательностей ДНК (продолжение) Рестриктазы II типа: • представлены двумя отдельными белками (рестрикционной эндонуклеазой и модификационной метилазой). • Относительно просто организованные белки, они состоят из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Для действия этих ферментов нужны только ионы Mg. • Характеризуются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктазы II типа узнают определенную последовательность ДНК и вызывают ее разрыв внутри этой последовательности. • Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены - палиндромами • Рестриктазы II типа активно используются в генноинженерных манипуляциях и других генетическимолекулярных исследованиях.
Рекстриктазы II типа • Палиндром – это когда в двух цепях ДНК последовательности одинаковые, но идут в противоположных направлениях. • Палиндромы являются сайтами действия рестриктаз, играют важную роль в обеспечении процессов терминации транскрипции, а также участвуют в ряде других процессов. • Пример палиндрома (или сайта рестрикции):
1) В результате действия рестриктаз II типа образуются фрагменты ДНК с тупыми (ровными) концами Примером таких рестриктаз является фермент Bal I :
2) В результате действия рестриктаз II типа образуются фрагменты ДНК с липкими (неровными) концами • Примером таких рестриктаз является эндонуклеаза Eco. R 1 :
• Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных условиях. • Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от: р. Н, ионной силы раствора, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции.
• Число известных и охарактеризованных рестриктаз непрерывно растет, т. к. эти ферменты используют в биотехнологических и молекулярногенетических исследованиях.
Вопросы 3. Генная инженерия, клонирование генов в клетках микроорганизмов
• «Генная инженерия – совокупность методов, позволяющих создавать in vitro рекомбинантные молекулы ДНК, с последующей передачей этих новых генетических структур из одного организма в другой. Цель генной инженерии состоит в получении клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые “человеческие” белки; в возможности преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (использование в селекции растений, животных). » • Так как с химической точки зрения ДНК всех организмов однотипна, то in vitro возможно воссоединение фрагментов ДНК из любых организмов.
Наиболее используемым методом генной инженерии является метод конструирования и переноса рекомбинантных ДНК. Этот метод включает несколько этапов: • 1. Создание вектора. Конструирование вектора состоит из двух последовательных стадий: рестрикции и лигирования. • 2. Введение вектора (рекомбинантной молекулы ДНК) в реципиентные клетки (обычно клетки бактерий) с помощью трансформации. • 3. Скрининг – отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген. Этот этап выполняется с использованием различных методов. • 4. Культивирование отобранных бактерий с целью размножения полученных клонов (клонирование).
Схема эксперимента по конструированию рекомбинантной ДНК и клонированию генов в клетках бактерий (См. Приложение) Чужеродную ДНК и ДНК плазмиды разрезают in vitro с помощью одной и той же рестриктазы. При этом получаются фрагменты с «липкими» концами. В результате смешивания таких фрагментов и обработки лигазой образуются плазмиды с включенной в них эукариотической ДНК. Эти гибридные ДНК можно вводить в подходящие бактерии в результате трансформации и размножать, получая многочисленные клоны.
Метод клонирования нашел широкое применение С его помощью можно получать микробиологическим путем продукты, использующиеся человеком. В настоящее время разработаны методы микробиологического получения гормона инсулина, в котором нуждаются больные диабетом. Раньше его получали путем экстрагирования из поджелудочных желез коров, свиней, что очень сложно и дорого. Разработаны методы получения интерферонов – белков, обладающих антивирусным действием; соматостатина – гормона роста и др. Гены, детерминирующие синтез этих веществ, клонированы в основном в клетках E. coli.
Вопросы 4. Успехи и проблемы биотехнологии
• Биотехнология, в сущности, не что иное как создание суперпродуцентов на основе микробных и растительных или животных клеток, способных синтезировать любые белковые вещества, имеющие практическое значение. • Согласно определения Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г. , биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, микробиологии, генетики, химической технологии, математики, экономики позволяет извлекать выгоду в технологических процессах из свойств микроорганизмов и клеточных структур.
Проблемы биотехнологии Их условно можно разделить на три группы: 1. Методические. 2. Экономические. 3. Этические и политические.
Схема получения трансгенного растения Регенерация трансгенного растения из неорганизованной массы делящихся клеток
Трансгенные растения • Создание одного нового сорта растений ГМР стоит от 50 до 300 млн долларов и занимает от 6 до 12 лет. Площади (в млн га), занимаемые трансгенными культурами во всем мире. Общая площадь насаждений (в млн га) в 2002 году и доля в ней трансгенных растений.
Отношение в мире и, частности в Европе, к ГМ (генномодифицированным)-продуктам • в 1998 г. страны – члены Евросоюза ввели пятилетний мораторий на производство продуктов питания из ГМ-организмов и импорт ГМпродуктов. Де-юре мораторий был снят в 2003 г. , однако до сих пор в Европе коммерчески не производят трансгенные растения. • В 2000 г. был подписан Картахенский протокол по биологической безопасности, ограничивающий распротранение ГМ-организмов. На сегодняшний ден к нему присоединились 180 стран (Россия –нет). • В 2004 г. Всемирный союз охраны природы признал ГМ-организмы «чужеродными, угрожающими стабильности экосистемы» и обратился к правительствам разных стран с призывом о запрещении их коммерческого использования. • В РФ и Беларуси до сих пор не разрешено коммерчески выращивать ни одно трансгенное растение. В последние годы, согласно решению Минздравов этих стран, проводится обязательная регистрация пищевых продуктов с трансгенными компонентами: например, с компонентами сои, кукурузы, рапса, сахарной свеклы, картофеля.
Маркировка ГМ-продуктов Этикетка на продуктах, содержащих трансгенную сою. Маркировки, обозначающие отсутствие генетически модифицированных компонентов в продукте.
Перечень фирм, продукты которых содержат трансгенные компоненты • Kelloggs (Келлогс) — производит готовые завтраки, в том числе кукурузные хлопья • Nestle (Нестле) — производит шоколад, кофейные напитки, детское питание • Unilever (Юнилевер) — производит детское питание, майонезы, соусы и т. д. • Heinz Foods (Хайенц Фудс) — производит кетчупы, соусы • Hersheys (Хёршис) — производит шоколад, безалкогольные напитки • Coca-Cola (Кока-Кола) — Кока-Кола, Спрайт, Фанта, тоник «Кинли» • Mc. Donalds (Макдональдс) — сеть «ресторанов» быстрого питания • Danon (Данон) — производит йогурты, кефир, творог, детское питание • Similac (Симилак) — производит детское питание • Cadbury (Кэдбери) — производит шоколад, какао • Mars (Марс) — производит шоколад Марс, Сникерс, Твикс • Pepsi. Co (Пепси-Кола) — Пепси, Миринда, Севен-Ап
Выводы 1. Можно полагать, что многие опасения, связанные с генномодифицированными продуктами (ГМП), безосновательны. Поскольку на сегодняшний день многие гипотетические возражения оппонентов ГМП недоказуемы. Хотя, несомненно, генно-инженерные исследования должны находиться под контролем сообщества ученых, общественности и правительства. 2. Генетические исследования ведутся серьезными и ответственными учеными, а методы, позволяющие свести к минимуму возможность случайного распространения потенциально опасных микробов, все время совершенствуются. 3. Оценивая возможные опасности, которые генетические исследования в себе таят, следует сопоставлять их с подлинными трагедиями, вызванными недоеданием и болезнями, губящими и калечащими людей.
Скачать презентацию Тема 22 Генетическая инженерия плазмиды 1 Плазмиды бактериальных
755186b6842dbf9ae0fc26bb7a6549db.ppt