ТЕМА 2 ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ РЕЖИМ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК В

ТЕМА 2 ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ РЕЖИМ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК В ГИСТОГЕНЕЗАХ

1. Изменение параметров пролиферации в онтогенезе • В онтогенезе происходит закономерное изменение (главным образом, снижение) темпов клеточного размножения (= темпов пролиферации). • Существуют 3 способа (причины) снижения темпов пролиферации: 1. Изменение параметров цикла (удлинение цикла, увеличение Т). Результат – замедление делений клеток. 2. Временный выход в состояние покоя G 0. Результат – снижение пролиферативного пула (% циклирующих клеток). 3. Выход части клеток из цикла в дифференцировку, как правило, необратимый. Результат – снижение пролиферативного пула. • Т. о. , по мере индивидуального развития: - доля делящихся клеток (пролиферативный пул) уменьшается; - продолжительность митотических циклов увеличивается. При старении темп размножения клеток снижается во всех тканях. • Проследим эти важные закономерности в онтогенезе.

1. 1. Ранний эмбриогенез • Первые циклы зиготы (дробление) В цитоплазме яйца (ооплазме) есть все предшественники и регуляторы для репликации ДНК. Запас нуклеотидов в 1000 -100000 раз больше, чем в соматической клетке. Но ядро яйцеклетки блокировано на границе G 1/S. Не хватает активирующего фактора (контакт со спермием, кортикальная реакция). После оплодотворения в мужском и женском пронуклеусах синхронно начинается синтез ДНК, который длится обычно до 20 мин (редко до 1 -2 ч). После короткого G 2 -периода или сразу после S оба пронуклеуса синхронно вступают в митоз (NB: должен быть цитоплазматический стимул на митоз!).

• Циклы первых делений дробления: Объект Т (мин) t. G 1 t. S t. G 2 t. M Насекомое Leptinotarsa 120 0 20 85 15 Морской ёж Strongylocentrotus 110 0 55 Моллюск Lymnaea 83 0 22 21 40 Рыба Misgurnus 30 0 5 10 15 Рыба Salmo 365 0 120 100 145 Лягушка Xenopus 30 0 15 • Видны общие закономерности первых циклов: - Первые циклы наиболее короткие. - Отсутствует G 1 -период (универсально!); у млекопитающих до 32 бл-меров. - Минимально короткий S-период (до 5 -7 мин; мухи, некоторые рыбы и др. ). Высокий пул нуклеотидов и полная синхронизация репликонов. - Высокая синхронность циклов дробления – активность цитоплазматических активаторов SPF и MPF. Синхронность продолжается даже после разобщения бластомеров. • NB: На стадии бластулы сформирован фонд эмбриональных стволовых клеток (embryonic stem cells) – тотипотентных, способных к любым дифференцировкам.

• Гаструляция К стадии 32 -64 бластомеров (± видоспецифично) появляется асинхронность делений бластомеров. Запас внутриклеточных стимуляторов митоза снижается. Синтез новых регуляторов МЦ начинает контролироваться экзогенно (индукция от соседних клеток). Возобновляется морфогенетическая функция ядер бластомеров – транскрипционная активность, направленная на синтез структурных белков и белков-регуляторов цикла и дифференцировки. До сих пор в ядре происходила только репликация ДНК. В это время и появляется G 1 -период – перерыв между М и S.

Образование G 1 -периода в раннем эмбриогенезе морского ежа (Андреева и др. , 1990) До 10 -го цикла G 1 и G 2 отсутствуют, скорость S между митозами постоянная. Начиная с 11 -го цикла, в первой половине интерфазы скорость репликации ДНК постепенно снижается в результате конкуренции ауто- и гетеросинтезов. На основе этого и формируется G 1 -период. Типичная структура цикла (G 1 -S-G 2 -M) складывается к 14 -му делению дробления, хотя G 2 еще слабо выражен. Т. о. , G 1 и G 2 формируются постепенно, по мере включения гетеросинтезов – синтезов РНК и белков для дифференцировки клеток и эмбриональных зачатков.

• Гаструла Сформированы нормальные циклы, хорошо выражен G 1 -период. У мыши: Т = 6 -7 ч, t. S = 4 ч; пролиферативный пул (Р) = 95 -100 %; интенсивное размножение и миграция клеток. • Нейрула и ранний органогенез Дальнейшая пролиферация и перемещение клеточных масс. Нормальные циклы, удлинение G 1 и G 2 в результате усиления гетеросинтезов. В зачатках органов наблюдается устойчивое снижение Р – до 90 -80 %. Т. е. часть клеток выходит в дифференцировку или в апоптоз. Это – начало гистогенезов. • NB: С началом эмбриональных гисто- и органогенезов уменьшаются потенции эмбриональных стволовых клеток – переход от титипотентности к плюрипотентности.

1. 2. Становление дефинитивных циклов в тканевых камбиях Колоссальная работа 60 -70 -х годов по выявлению кинетики клеточных популяций в онтогенезах млекопитающих, других животных, растений, а также в клеточных культурах (3 Н-тимидиновая авторадиография). В России – А. А. Заварзин (мл. ), П. П. Румянцев, А. К. Дондуа, О. И. Епифанова и др. Установлено, что в ходе эмбриональных и постэмбриональных гистогенезов происходят изменения не только пролиферативного пула, но и параметров митотических циклов, времени жизни клеток. Это связано с переходом от эмбриональных к «взрослым» , тканевым стволовым клеткам (edalt stem cells) – мульти-, олиго- и унипотентным. В циклах наиболее стабильные периоды G 2 и М, менее стабилен S, самый изменчивый G 1 -период.

• G 1 -период Обычно G 1 -период постепенно удлиняется по мере развития зачатков и дифференциации клеток – до 6 -12 ч и более. Происходят задержки до нескольких суток - это уход в G 0 -период. В разных зачатках удлинение G 1 -периода происходит в разных пропорциях относительно других периодов. В популяции разновозрастных клеток имеем гетерогенность по G 1 -периоду – сочетание циклов с короткими и длинными G 1 (см. стадии 2 и 3 в зачатке спинного мозга). 1, 2, 3, 4 – шаги к выходу их цикла в дифференцировку.

• S-период – более стабильный, но в развитии зачатков закономерно изменяется. Его длительность определяется степенью синхронности репликации отдельных репликонов: при полной синхронности S = 5 -7 мин (период дробления зиготы), при десинхронизации – несколько часов. У млекопитающих средний S = 6 -9 ч, в отдельных случаях 3 -4 или 12 ч и более. Асинхронность репликации и удлинение S возникают с началом дифференцировки клеток в популяции, при включении гетеросинтезов, совмещенных с аутосинтезами. Сочетание ауто- и гетеросинтезов и удлинение S характерно для тканей без оформленного камбий, где нет сильной конкуренции между этими синтезами (печень, различные железы, миокард в эмбриогенезе).

• Индукция дифференцировки – многофакторное явление. Велика роль гормонов из эндокринных желез и местных источников (например, влияние соединительной ткани на развитие эпителиев). На определенных этапах гистогенеза S-период может временно сокращаться. Например: - В эпителии молочной железы при беременности S сокращается с 20 до 8 ч (действие гормона пролактина); - В эпителии спинки языка (эмбрион мыши) между 16 и 18 днями S сокращается с 7 до 5 ч, потом восстанавливается. Причина: на 17 -й день начинается кератинизация эпителия, формируются сосочки и усиливается действие индукторов соединительной ткани. Влияют также внешние факторы, например, температура среды. У новорожденных крысят заметно снижается температура тела, так как еще отсутствует терморегуляция. Поэтому в кожном эпителии, железах, нефронах скорость синтеза ДНК замедляется – S-период удлиняется с 7 -8 до 10 ч.

• G 2 -период Наиболее стабильный период (3 -4 ч), так как все готово к митозу, идут лишь стандартные процессы подготовки профазы. Но и здесь могут быть задержки – могут формироваться G 2 -популяции клеток, готовые быстро вступить в митоз (например, в печени). Причина задержки G 2 – блокирование контрольной точки (check point) в регуляторном механизме цикла.

1. 3. Соотношение пролиферации и дифференцировки клеток Аутосинтезы (синтез ДНК, РНК и белков для митоза) и гетеросинтезы (РНК, белки и др. для дифференцировки и работы клетки) взаимоконкурентны, так как требуют одной и той же матрицы, рибосом, АТФ, предшественников. Тем не менее, абсолютного антагонизма между ними нет, возможно их совмещение. Дифференцировка клеток детерминируется и даже начинает реально осуществляться в ходе митотических циклов. При развитии печени, сердца, крови первые признаки специализации клеток проявляются в ходе митотических циклов (появляются тканевые белки, цитоскелетные структуры, органеллы). При этом удлиняется Sпериод (см. выше). То же происходит в дефинитивных тканях при их физиологической и репаративной регенерации. Более того, подавление митозов вызывает и остановку дифференцировки клеток. Т. о. , старое представление об антагонизме и несовместимости пролиферации и работы клеток неверно. На определенных этапах развития совмещение возможно и даже необходимо. Тканеспецифичная экспрессия генов начинается уже в делящихся клетках.

• Однако терминальная дифференцировка, как правило, приводит к прекращению делений – клетки выходят из цикла. (Искусственная стимуляция синтеза тканевого белка в делящихся клетках (например, гемоглобина в клетках эритролейкемии), т. е. ускорение дифференцировки, приводит к досрочному прекращению делений – через 2 -5 циклов. ) • Выход клетки из митотического цикла происходит в точке r (точка рестрикции, check point), чувствительной к молекулярным регуляторам репродукции и дифференцировки. Рецепция сигнала (фиксация гормона на плазмалемме) возможна в любом периоде цикла (G 1, S, G 2), но реакция на него – выход из цикла – только в r. К этому времени собираются и активируются сигнальные пути клетки – рецепторный комплекс и цепь вторичных (цитоплазматических) месенджеров. Обычно выход происходит через несколько циклов после получения сигнала, в разных тканях по-разному: от 1 -2 до 10 и более циклов. Это зависит не столько от силы сигнала, сколько от возраста клеток – их удаления от «ствола» и приобретения компетентности к дифференцировке.

Схема развития клеточных дифферонов кишечного эпителия млекопитающих 3. Терминально дифференцированные клетки. Гетеросинтезы, работа, смерть. 2. Прогениторные коммитированные клетки (клетки-предшественницы). Приобретение унипотентности. Совмещение репродукции и дифференцировки клеток (ауто- и гетеросинтезы). Формирование клеточных клонов. (= Полустволовые клетки) 1. Мульти(Олиго)потентные стволовые клетки. «Глухие» аутосинтетические циклы, преобладает G 0 -период.

• Выделяют следующие клеточные сообщества: 1) Дифферон – совокупность клеток разных стадий и направлений развития, происходящих из 1 тканевой стволовой клетки. 2) Клеточный клон – группа однородных клеток определенной специализации, развивающихся из прогениторной унипотентной клетки. Клон – часть дифферона. 3) Клеточная субпопуляция – совокупность однотипных клеток (клонов), происходящих из множества дифферонов (= морфофункциональный клеточный тип). 4) Клеточная популяция – сумма всех клеток однотипных дифферонов, т. е. происходящих из определенного типа тканевых стволовых клеток. Могут быть гомогенные (эпидермис) и гетерогенные (кишечный эпителий, кровь) клеточные популяции. 5) Ткань – совокупность клеток и межклеточного вещества, происходящих из нескольких, иногда одного (эпидермис), типов СК и объединенных выполнением общей функции. • 1 – 4 – категории гистогенетические, 5 – морфофункциональная.

2. Редукция митоза в клеточном цикле. Многоядерность, полиплоидия и политения • Как было видно, при совмещенных ауто- и гетеросинтезах (т. е. при одновременном протекании процессов пролиферации и дифференцировки) изменяются параметры клеточного цикла: удлинение G 1 и S, задержки G 0 и G 2. • С дифференцировкой клеток связаны и более радикальные изменения цикла - исключение митоза или его отдельных стадий (редукция митоза, митотический блок) с возможностью перехода в следующий цикл. • Т. о. , происходят неполные циклы (эндоциклы) – умножение числа геномов без разделения клеточного тела = эндорепродукция клеток в той или иной форме. • Результат – многоядерность, полиплоидия или политения – зависит от стадии митоза, на которой происходит блокирование, и от числа пройденных эндоциклов. Эндорепродукция сопровождается ростом клеточного тела.

2. 1. Механизмы эндорепродукции (в порядке углубления аномалий митоза) (1) Ацитокинетический митоз (блок цитокинеза) в результате неполной подготовки микрофиламентов и (или) дисфункции аппарата Гольджи. • Результат – двуядерная клетка (2 n + 2 n), при повторениях – многоядерная клетка. Это обычная картина во многих тканях у животных и растений, когда дифференцировка накладывается на цикл (у млекопитающих – печень, сердце, гладкие мышцы, железы, фибробласты, макрофаги и др. ). За двуядерностью может последовать нормальный митоз с образованием двух 4 n-клеток, снова двуядерность и т. д. Типично для гепатоцитов мыши. 2 с 4 с По: Ченцов (2004) 2 с 4 с 4 с 8 с 4 с

(2) Мета-, ана-фазный блок (К-митоз, полиплоидизирующий митоз) в результате нарушения работы, недостаточной подготовки или полного отсутствия веретена, нерасхождения центриолей (униполярный, триполярный митоз). • Результат – 1 -ядерная полиплоидная (4 n-, 8 n-, 16 n) клетка, гантелевидные или многолопастные ядра, 2 -3 ядерная клетка с неравными ядрами (имитация амитоза). Аномальный (верхний ряд) и нормальный (нижний ряд) митоз в белковой железе улитки. Трехполюсный митоз в культуре клеток He. La – результат нарушения дупликации и расхождения центриолей.

NB: Сочетания ацитокинезов и метаанафазных блоков дают полиморфные гетероплоидные клеточные популяции. Типичный пример – культура клеток He. La. Многоядерная клетка He. La. Фазовый контраст; ядрышки окрашены Ag. NO 3. Мосты, полиплоидные митозы, многоядерность в культуре клеток He. La.

(3) Эндомитоз – митоз внутри ядра, без разрушения ядерной оболочки и ядрышка, без формирования веретена. Хромосомы в интерфазе реплицируются, потом спирализуются (эндопрофаза), свободно и беспорядочно лежат в ядре (эндометафаза), расщепляются (эндоанафаза) и деспирализуются (эндотелофаза). Циклы повторяются многократно.

Ультраструктура эндомитоза в клетках белковой железы улитки: отсутствие веретена, сохранение ядерной оболочки, митотическая конденсация хромосом. Но: сохраняется слабая транскрипция (до 3% от интерфазного максимума).

NB: Эндомитотическая (соматическая) полиплоидия ведет к клеточному гигантизму. Размеры клеток, масса и синтез РНК, белков, гликогена, активность ферментов и другие свойства возрастают примерно пропорционально уровню плоидности ядра. Клетки He. La: 2 n, 4 n, 8 n, 16 n. Церебральный (А) и педальный (В) ганглии улитки. Гигантские нейроны.

(4) Политения – возникает в результате многократной эндоредупликации хромонем без их разделения. Митоза вообще нет. Образуются гигантские политенные хромосомы (до 512 -1024 с и более). Их число остается 2 n (или n при конъюгации гомологов). Хромосомы активные, так как все происходит в интерфазе. Транскрипция выявляется в пуфах (кольцах Бальбиани). 4 политенные хромосомы (1 n) дрозофилы. В кружке 2 n митоз. Ченцов (2004) Эндоредупликация хромонем. Хромомеры складываются в диски. Активные хромомеры дают петельные домены, получается пуф. Преобразование диска в пуф под действием гормона линьки экдизона у дрозофилы.

Т. о. , соматическая полиплоидия и политения возникают в результате той или иной аномалии митоза, его преждевременного завершения или полного выпадения с досрочным переходом в новую интерфазу. По степени редукции митоза, способы эндорепродукции и последующие состояния клетки подразделяются на: 1 - ацитокинетический митоз (=многоядерность); 2 – мета-анафазный блок (=полиплоидия, многоядерность); 3 – эндомитоз (=полиплоидия); 4 – эндоредупликация хромонем (=политения). Размер и биопродукция клетки пропорционально возрастают. Это возможно потому, что клеточный цикл включает три относительно самостоятельных цикла: хромосомный, центросомный и цитокинетический. Возможно их рассогласование и разобщение.

2. 2. Распространение соматической полиплоидии и политении в эволюции Это важно знать для выяснения причин и биологического значения соматической полиплоидии, ее роли в эволюции морфогенезов. Соматическая полиплоидия (не путать с генеративной, организменной полиплоидией!) и политения возникали как вариации механизмов роста и гистогенеза в разных группах. • Бактерии (включая архей) – гаплоидные одноклеточные прокариоты (одна хромосома). Но циклы репликации ДНК могут опережать циклы деления клетки (растяжения мембраны). Новая репликация может начинаться, когда еще не завершилась предыдущая. В итоге клетки содержат более 1 с ДНК (до 5 -10 крат). Это полиплоидия. • Протисты. Ядра радиолярий – полиплоидные (тысячи n). Опалина и др. – многоядерные клетки (десятки, сотни ядер; митоз без цитокинеза). Инфузории – гигантский полиплоидный макронуклеус (до 100 тыс. с ДНК; сочетание полиплоидии, политении и частичной редукции хроматина). Водоросли – широко распространена многоядерность, симпластичные талломы.

• Растения. По мохообразным, папоротникам и голосеменным информации нет. У покрытосеменных в большинстве тканей (эпидермис, проводящие, паренхима и др. ) преобладают диплоидные клетки, но есть также 2 ядерные и полиплоидные (2 n+2 n, 3 n, 4 n, 6 n, 8 n), образующиеся посредством неполных митозов. Бывает также эндоредупликация (политения). Гигантская политения, причем облигатная (во всех клетках), типична для некоторых тканей цветка и эндосперма эмбрионов (тысячи гаплоидных значений ДНК). • Животные. • Кишечнополостные. У гидр и медуз не известно (по-видимому, нет). У полиподиума (паразит икринок осетровых рыб) трофическая клетка многократно полиплоидизируется (механизм неясен).

• Гребневики, плоские черви и другие «низшие» – информации нет. • Нематоды. Характерна эутелия. У свободноживущих в основном клетки диплоидные; есть отдельные случаи 4 -8 с-клеток (факультативно). • У паразитов (аскарида) гигантская полиплоидия в пищеводных железах (всего 3 клетки по 130 -260 тыс. с), в эпителии матки (двуядерность, ядра до 1024 с) – облигатно! Даже в кишечном эпителии на фоне общей диплоидности появляются 4 -8 -16 -32 с-клетки в результате аномалий митоза (блок цитокинеза, анафазы или метафазы). Рис. Пищевода, матки, кишки аскариды

• Ракообразные – низшие и высшие. В разных железах, нейронах – до 128 -264 с и более. Механизмы не известны. • Насекомые. Клопы, бабочки и др. Различные железы, трофоциты яичников, жировое тело, эпидермис и др. Митотические блоки (до 816 n), переходящие в эндомитоз (до 64 -128 n и даже до 1024 n). • Рекорд – слюнные железы гусеницы шелкопряда – гигантские разветвленные ядра, содержащие до 1 -2 млн гаплоидных значений ДНК. • Двукрылые (мухи, в т. ч. дрозофила, хирономус и др. ). Типична политения разной степени в разных тканях личинок – 1024 -2048 с. • NB: эндомитоз и политения в этих случаях облигатны, полиплоидизируются все клетки данного типа (вся субпопуляция). рис.

• Моллюски. Двустворчатые – полиплоидия практически отсутствует. Переднежаберные гастроподы – факультативно и в малой степени (4 -8 -16 с). Легочные и заднежаберные гастроподы – облигатно, в нейронах сотни тыс. с.

У легочных моллюсков полиплоидия – норма гистогенезов многих органов. Механизмы – неполный полиплоидизирующий митоз и эндомитоз. Улитка Succinea lauta: А - эпидермальные железы; В – слюнная железа; С – пищеварительная железа; D – кишечный эпителий; E – белковая железа; F – предстательная железа; G – нервный ганглий.

Типичные гистограммы распределения клеточных ядер по массе ДНК при развитии соматической полиплоидии в разных тканях (улитка Succinea lauta).

• Млекопитающие. В большинстве нормальных тканей и опухолей диплоидный гистогенез дает факультативно 1 -5% тетра-октаплоидных клеток, в т. ч. двуядерных (нарушения митоза). Печень, сердце – до 50 -80% полиплоидных (в т. ч. двуядерных) клеток: 4 -8 -16 -32 n. Мегакариоциты красного костного мозга – облигатная полиплоидия до 816 -32 -64 n (видоспецифично), но сохраняется 2 n камбий (стволовые клетки). Гигантские клетки трофобласта – нарушения митоза, эндомитоз, политения до 2048 -4096 с! Аналогии с полиподиумом, нематодами, моллюсками, насекомыми и др.

• 2. 3. Причины возникновения полиплоидных клеток в гистогенезах 1) Неполноценная подготовка клеток к митозу из-за конкуренции ауто- и гетеросинтезов. 2) Перестройки цитоскелета, связанные с дифференцировкой клеток, препятствующие нормальному митозу. 3) Программированное (? ) выключение генов MPF, управляющих митозом. Возможно, в разных случаях выступают разные причины. • 2. 4. Значение и биологический смысл соматической полиплоидии Эмпирических исследований значения соматической полиплоидии (эндополиплоидии) в гистогенезах нет. Учитывая распространенность этого явления, можно лишь предполагать те или иные преимущества (тот или иной смысл) полиплоидных гистогенезов по сравнению с обычными диплоидными. В интересах универсального толкования феномена полиплоидная клетка рассматривается нами как эндоклон, а эволюционное преобразование диплоидно-клеточных клонов в полиплоидные эндоклоны как олигомеризация на клеточно-тканевом уровне (Анисимов, 1999, Anisimov, 2005).

• В соответствии с теорией олигомеризации (Догель, 1956) нами рассматриваются свойства олигомерных систем, они же – особенности полиплоидной стратегии роста: - интенсификация функций, - функциональная экономичность, - упрощение внутрисистемной и надсистемной регуляций, - повышение надежности геномов, - ускорение развития. С этими универсальными свойствами соматическая полиплоидия выступает как форма онтогенетических корреляций и филогенетических координаций (в понимании И. И. Шмальгаузена, …. . ).

• Таким образом, эндополиплоидия представляет собой морфогенетический фактор, и ее значение надо рассматривать в двух аспектах: 1) Умеренная (обычно до 4 -8 n) факультативная полиплоидия возникает у отдельных видов филогенетической группы как алломорфные адаптации, связанные с некоторой интенсификацией клеточных функций. 2) Облигатная полиплоидия высоких степеней (сотни и тысячи n), характерная для больших групп, может нести все выше обозначенные преимущества олигомерных систем и выступает в качестве закономерных, более или менее ароморфных изменений онтогенеза.

3. Пролиферативный режим дефинитивных тканей Давняя проблема – классифицировать ткани взрослого организма по их митотической (=пролиферативной) активности. Биццоцерро, начало 20 -го века: неизменные, стабильные и лабильные ткани. Леблон (Leblond, 1964): стабильные, растущие, обновляющиеся. Камерон (Cameron, 1970): статические, обновляющиеся (частично, медленно и быстро обновляющиеся), неопластические (=трансформированные, злокачественные, раковые). Сегодня: акцент на наличие СК и их потенции к дифференцировке, но важны также темпы пролиферации.

• Критерии оценки пролиферативных свойств клеточных популяций. Способность к делению клеток вообще (наличие или отсутствие тканевых СК) в ткани, органе. Скорость и полнота обновления клеточной популяции. • Методы оценки. 1. Определение динамики численности клеток в популяции: по приращению суммарной ДНК в органе, прямым счетом числа клеток в проточнике или на микропрепарате. Зная возрастную динамику числа клеток на каком-то периоде роста органа, можно рассчитать суточный прирост числа клеток, ΔN. 2. Определение скорости клеточных делений: 3 Н-тимидин, колхицин, БДУ и др. маркеры. Можно рассчитать суточное число митозов, ΔМ. 3. Определение массы ДНК в ядрах на возможную полиплоидию и др. (Leblond, 1964)

• • 3. 1. Быстро обновляющиеся клеточные популяции Эпителий пищеварительного тракта, легкие, тимус и др. у взрослых, но еще медленно растущих крыс (240 г, 3 мес. ) (Leblond, 1964): Показатель Кишка Легкое Тимус Суточный прирост числа клеток ΔN 1 % 0, 5 % 0 % Суточное число митозов ΔМ 68 % 5 % 22 % Митозов происходит гораздо больше, чем необходимо для прироста числа клеток. Клеток образуется много, но сохраняется лишь малая часть; в тимусе прироста нет. Следовательно, большинство или даже все новообразующиеся клетки куда-то уходят – дегенерируют, мигрируют. Установлено, что уходят (отмирают, мигрируют) зрелые клетки, а молодые их замещают. (В отдельных случаях происходит апоптоз – гибель избыточных, даже молодых, клеток). • Т. о. , происходит обновление клеток (= физиологическая регенерация). Можно различать: - быстро обновляющиеся ткани (менее 30 сут), - медленно обновляющиеся ткани (более 30 сут, но полностью), - частично обновляющиеся ткани (не полное обновление). • Характерный признак обновляющихся популяций – наличие обособленного камбия, системы стволовых клеток. У беспозвоночных обычен диффузный камбий и возможна пролиферация дедифференцирующихся клеток.

Примеры быстро обновляющихся тканей • Кишечный эпителий млекопитающих. Однослойный эпителий, организован в системе «криптаворсинка» . Размножение клеток происходит в криптах – кольцо СК на дне крипты. Клетки (всасывающие, бокаловидные, энтерохромаффинные) мигрируют на ворсинки, где сползают еще живыми. Клетки Панета остаются на дне крипты. СК – мульти(олиго)потентные. Скорость обновления очень высокая – 2 -3 сут. По расчетам: У 3 -месячных крыс в пищеварительном тракте имеется 4 млрд клеток. Только в тонкой кишке ежедневно отмирает 1. 4 млрд клеток, а в расчете на весь ПВ тракт – более 2 млрд. Без пролиферации всего запаса клеток хватило бы на 2 дня! (Это и происходит при острой лучевой болезни). Но идет пролиферация СК со скоростью, равной скорости слущивания клеток. Т. о. , клеточная популяция находится в равновесном состоянии. • Аналогичная организация кишечного эпителия характерна для птиц, рыб и многих беспозвоночных (камбиальные гнезда у насекомых, время обновления – 2 сут). • Типичный пример гистологических параллелизмов (акад. Заварзин).

• Эпидермис млекопитающих. Многослойный ороговевающий эпителий. СК унипотентные, залегают в базальном слое, мозаично. Митозы продолжаются в шиповатом слое, терминальная дифференцировка клеток происходит в зернистом слое, ороговение и отмирание – в блестящем и роговом. Образуются колончатые диффероны. Полное обновление эпидермиса за 7 -10 сут. • (Популяция меланобластов-меланоцитов (М) в базальном слое – самоподдерживающаяся, происходит из нервного гребня эмбриона). • Альвеолярный эпителий легких. Однослойный плоский эпителий. Клетки мигрируют пластом из альвеол в альвеолярные ходы, далее – в бронхи и трахею. Сбрасываются в пищевод. Время обновления – несколько суток.

• Кровь и лимфа. Диффузная «жидкая» ткань. Система СК и бластов – в красном костном мозге. Лимфобласты пролиферируют также в периферических органах (тимус, селезенка, лимфоузлы). СК – плюрипотентные, мезенхимного происхождения. Время обновления лейкоцитов – 10 -15 сут, эритроцитов – 100 -120 сут. • По расчетам: у человека всего 20 млрд эритроцитов. В каждую секунду в кровь поступает более 2 тысяч клеток и столько же гибнет. ______ «» _____ NB: Интенсивное обновление клеток имеет большой биологический смысл. В эпидермисе – рост барьерной ткани навстречу внешней среде, упреждение износа, загрязнения, инфицирования. При травме - быстрое автоматическое заживление. В кишечнике, легких – то же, с учетом химически и биологически агрессивной среды. В крови и лимфе – возможность быстрого иммунного ответа, рост на опережение с инфекционными и инвазивными агентами. Организм растет навстречу внешней среде! Это гарантия защиты от вредных факторов.

• 3. 2. Медленно и частично обновляющиеся клеточные популяции Паренхима печени, почек, надпочечника, поджелудочной, щитовидной и др. желез, мышцы, соединительные ткани. Как и в быстро обновляющихся тканях, количество ДНК в органе экспоненциально увеличивается, т. е. растет и число клеток (хотя часто возникают 4 -8 n-клетки). Митозы есть, но их мало, нет четкого камбия. СК разбросаны поодиночке, диффузно. Возможна дедифференцировка и деление зрелых клеток. • В надпочечнике 3 -месячных крыс: ΔN = 0, 23 %, ΔМ = 0, 22 %. Т. е. количество митозов таково, что обеспечивает лишь прирост числа клеток, происходит рост органа без обновления? Леблон определил эти слабо пролиферирующие ткани как растущие клеточные популяции. Клетки после деления долго остаются в ткани, никуда не мигрируют и не погибают. Жизнь клеток неограниченно долгая. Позднее выяснилось, что у взрослых крыс, при стабильном числе клеток (в отсутствие прироста) митозы все же идут. Таким образом, это слабо обновляющиеся клеточные популяции или частично обновляющиеся.

• Печень – полное обновление за несколько месяцев. СК – «овальные клетки» возле артериол в междольковых триадах. Но при повреждениях (токсикоз, гепатэктомия) возможно резкое усиление пролиферации (репаративная регенерация печени) с активизацией СК. Частая регенерация – путь к злокачественной трансформации клеток. • Скелетная мускулатура. Ткань образована гигантскими многоядерными симпластами – поперечнополосатыми мышечными волокнами. Однако сохраняется фонд СК – «клетки-сателлиты» , тесно прилежащие к волокнам. СК обеспечивают полную регенерацию мышцы при травме, после хирургических операций.

• Соединительная ткань. • Рыхлая и плотная соединительные ткани сохраняют СК-перициты – в контакте с капиллярами. Дают фибробласты и, далее, фиброциты. • Хрящевая ткань – тот же источник в надхрящнице – хондробласты и хондроциты. • Костная ткань – аналогично в надкостнице: остеобласты , остеоциты. • Гладкая мускулатура и т. п. производные мезенхимы – медленно или частично обновляемые ткани. Все они хорошо регенерируют. • Эпителий мочевого пузыря. СК хорошо обособлены (базальные клетки), но деления очень редкие. Частично обновляемая ткань. NB: у беспозвоночных часто выражена сезонная динамика пролиферативной активности, всплески обновления весной после зимней спячки или осенью после нереста. Ритмы поддерживаются гормонами. Большие регенераторные потенции на основе стволовых и дедифференцирующихся клеток.

• 3. 3. Стабильные клеточные популяции Нейроны ЦНС, кардиомиоциты млекопитающих, эутелические органы беспозвоночных. Леблоном (1964) в мозжечке крысы выявлено постоянство количества ДНК от рождения до 3 мес. Тимидин или БДУ не включаются. Митозы даже с колхицином не выявляются. Размножение клеток заканчивается в эмбриональном развитии. Но орган растет за счет роста самих клеток. Эутелия у нематод, коловраток, некоторых насекомых означает строгую стабилизацию числа клеток в каждом органе (результат детерминативного пути развития). Т. о. , постнатальный рост органов, образованных стабильными клеточными популяциями, идет без пролиферации – только за счет увеличения размеров клеток. Резерв СК не сохраняется! Часто рост дополняется эндорепродукцией: многоядерность (кардиомиоциты), полиплоидия (многие нейроны), политения (у мух) и др. Обновление структур – внутриклеточное (протеасомы, лизосомы).

NB: абсолютного запрета на пролиферацию для нейронов нет! • Многие чувствительные нейроны у млекопитающих, членистоногих, моллюсков увеличивают свою численность с ростом животных и способны к регенерации. • У низшие брюхоногих моллюсков регенерируют даже целые ганглии после их удаления (СК в коже). У высших улиток эта способность утрачивается. • Обнаружены СК в мозге млекопитающих , в подкорковых областях. Сохраняют способность к делению даже после смерти организма. • Получены делящиеся нейробласты в культуре. • «Запрет» на пролиферацию в стабильных тканях обусловлен особенностями их функционирования. Нейроны ЦНС и кардиомиоциты образуют протяженные сетевые электропроводящие системы (возбудимые ткани). Пролиферативное обновление ткани не совместимо с поддержанием функциональной стабильности таких сетей, так как митоз выключает клетку из системы межклеточных контактов. Это нарушало бы электропроводимость сетей и работу жизненно важных органов (мозга, сердца).

4. Покоящиеся (G 0) клетки 4. 1. Открытие G 0 -периода • Уже в первых работах 1960 -х годов показана большая гетерогенность клеток по G 1 -периоду – от нескольких часов до многих суток. Стало ясно, что клетки выходят из цикла или задерживаются в G 1 на неопределенное время. Возникло представление о периоде покоя – G 0. Куда выход и зачем? • NB: G 1 – «узкое место» цикла, так как в нем, через 3 -4 ч после очередного митоза открывается окно чувствительности клетки к внешним регуляторам – точка r – restrict point, check point (точка ограничения, контрольная точка, точка принятия решения и т. п. ). • В r-точке клетка чувствительна к ростовым факторам, ингибиторам, аминокислотному голоданию, контакту с другими клетками, понижению температуры и др. факторам. • Т. о. , сформулировано одно из фундаментальных свойств клетки – отвечать на внешний сигнал в определенной фазе цикла. • Возможные пути: в новый цикл, в дифференцировку, в апоптоз, в покой.

• 4. 2. Свойства G 0 -клеток • Модель G 0 -клеток – стационарная фаза роста клеточной культуры при недостатке сыворотки (ростовых факторов), пониженной температуре, контактном торможении (полном покрытии субстрата). • При добавлении сыворотки, нормализации температуры, пересеве на свободный субстрат через некоторое время (= пререпликативный период) клетки вступают в S-период нового цикла (=индуцированная пролиферация). • Время пререпликативного периода обычно = 10 -20 ч, но сильно зависит от длительности предшествующего покоя. Чем дольше клетки находились в стационарной (G 0) фазе, тем больше требовалось времени для вхождения в новый цикл (= тем дольше был пререпликативный период) и слабее был пролиферативный ответ (пул, %). (по: Епифанова и др. , 1983)

• Т. о. , происходит не просто переход, а постепенное углубление клеток в состояние покоя. Установлено, что G 0 – качественно новое состояние, другие белки и процессы. • - По мере углубления в G 0: - Снижается транскрипция. - Повышается концентрация ц. АМФ и, соответственно, снижается чувствительность клетки к стимуляторам и к повреждающим факторам. - Усиливаются катаболитические процессы, специальные синтезы РНК и белков для поддержания метаболизма покоя. Белок р27. - Усиливается блокирование ориджин-ДНК на ядерном матриксе. - Усиливается прикрепление микротрубочек и микрофиламентов к плазмалемме, а сама клетка распластывается на субстрате.

• 4. 3. Выход клеток из G 0 При стимуляции G 0 -клеток, на протяжении пререпликативного периода происходят структурно-биохимические изменения и приобретение компетенции к синтезу ДНК – реакции плейотипического (множественного) ответа: - Изменение проницаемости плазмалеммы, перестройка ионного гомеостаза, снижение концентрации ц. АМФ. - Повышение активности РНК-пол. - 2 -фазный рост синтезов РНК и белка: первая фаза –плейотипическая реакция (на старых рибосомах), вторая фаза - для прохождения нового цикла (требуется активация ядрышек и образование новых рибосом). - Синтез мембранных липидов и др. синтезы. В целом – радикальное изменение (по: Епифанова и др. , 1983) всего метаболизма.

• 4. 4. Биологический смысл состояний покоя 1. Переживание неблагоприятных условий среды. G 0 -клетки способны переживать недостаток питательных веществ и энергии, низкие температуры и др. неблагоприятные факторы. Особенно типично для бактерий и протистов. Споры и цисты разных организмов, зимние и летние спячки животных, семена растений, любой другой анабиоз. 2. Эмбриональная диапауза на стадии бластулы. В эмбриогенезе многоклеточных животных, на стадии бластулы, когда впервые появляется G 1 -период, появляется и первая возможность перехода в G 0. У млекопитающих она используется для задержки развития бластоциста и его имплантации в стенку матки (до нескольких месяцев) при неблагоприятных условиях для беременности, при перенаселении популяции и других стрессах. Эмбриональная диапауза воспроизводится in vitro при культивировании бластоцист на среде без сыворотки крови.

3. Переход клеток в G 0 -период как фактор морфогенеза, регулирующий сбалансированный рост зачатков. Пример: рост роговицы глаза согласован с закладкой и ростом век. Временная остановка пролиферации. 4. G 0 -резерв дифференцированных клеток. Например, ооциты млекопитающих – резерв на всю жизнь. Возможно, такие G 0 -блокированные зрелые клетки есть в печени и др. органах. 5. G 0 -резерв стволовых клеток. Все СК основное время своей жизни находятся в G 0 -периоде – гарантия сохранности и защищенности от мутаций. У животных это первичные половые клетки (до заселения гонад), гонии, тканевые СК. У растений – СК меристем (покоящиеся центры в кончиках корней между чехликом и основной меристемой, то же на верхушках побега). Дремлющие почки в тканях луба.