Тема 2 Оптические методы анализа 1 Рефрактометрический

Тема 2. Оптические методы анализа.

1. Рефрактометрический метод анализа. • Данный метод основан на зависимости показателя преломления n от концентрации двухкомпонентных растворов или смесей двух жидкостей (рефрактометрия твёрдых веществ в анализе пищевых продуктов не применяется). • Достоинства метода: • относительная простота аппаратуры и техники выполнения, • высокая точность измерений ( 10 -4 до 10 -2 %), • экспрессность ( несколько минут), • является микро-методом ( 1 -2 капли анализируемой жидкости). • Недостатки: только для жидких продуктов, спектр анализируемых веществ. • Метод основан на преломлении луча света при переходе из одной среды в другую.

Рис. А – преломление луча света при прохождении из менее плотной среды 1 в более плотную среду 2. Рис. Б – преломление луча света при углах падения приближающимся к 90 о, предельный луч D-D / (полное внутреннее отражение). Когда угол падения меньше 90 о направление луча света при переходе из одной среды в другую изменяется (луч преломления B- B/). Отношение синуса угла падения к синусу угла преломления представляет собой показатель преломления.

Устройство рефрактометра 1 – свет от источника 2 – зеркало 3 – осветительная призма 4 – измерительная призма 5 – компенсатор 6 – объектив 7 – призма 8 – пластина с фрезерными метриками 9 - окуляр

Устройство рефрактометра основано на явлении полного внутреннего отражения луча света на границе двух сред: стеклянная призма и анализируемый раствор, или на положении предельного луча на границе светотени. Свет от источника света 1 попадает на зеркало 2 и, отражаясь, проходит в верхнюю осветительную призму 3, затем в нижнюю измерительную 4, изготовленную из специального стекла. Между призмами 3 и 4 в капилляр помещают 1 -2 капли анализируемой жидкости. Поверхность 4 служит границей раздела, на которой происходит преломление луча света. Вследствие рассеивания лучей граница светотени получается радужной. Компенсатор дисперсии 5 устраняет это явление. Далее свет проходит через объектив 6 и призму 7, шкалу 8 наблюдаем в объектив 9.

Показатель преломления зависит от: температуры (с понижением температуры уменьшается); длины волны входящего света (чем меньше , тем больше показатель преломления). Влияющие факторы температура и длина волны указываются в виде индексов.

2. Поляриметрический метод анализа. Поляриметрия - метод анализа растворов оптически активных веществ, то есть имеющих в своём составе хотя бы один асимметрический атом углерода, и способных вращать поле поляризации луча света. Оптическая активность обусловлена особенностью строения молекулы вещества и кристаллической решётки вещества. Кристаллическая решётка при растворении вещества разрушается и оптическая активность исчезает. Если опт. активность вызвана наличием ассиметрического атомом углерода, то при растворении оптическая активность сохраняется. Угол вращения плоскости поляризации вещества зависит от природы оптически активного вещества и растворителя, длины волны света, толщины слоя раствора. При прочих равных условиях значение альфа зависит так же от концентрации раствора.

Изменение удельного вращения наблюдается в некоторых растворах вследствие перехода одной оптической формы вещества в другую – таутомерия. Поляриметрический метод анализа основан на том, что при прохождении луча света через оптически активное вещество кристаллическая решётка пропускает лучи определённого направления колебаний. После выхода из кристалла колебания луча света происходят в одной плоскости. Перпендикулярная ей плоскость называется плоскостью поляризации. Угол вращения плоскости поляризации измеряют поляриметром. Основными частями прибора являются две специальные призмы (призмы Николи). Одна призма неподвижна и служит для поляризации света (поляризатор). Другая предназначена для измерения угла вращения плоскости поляризации (анализатор).

При установлении призм параллельно другу луч света проходит через обе призмы (на рисунке А). Если анализатор повернулся на 90 градусов (рис Б) то луч, вышедший из поляризатора, не проходит через анализатор. В пространстве за анализатором свет не наблюдается. Если при таком положении призм поместить между ними раствор оптически активного вещества (рис В), то в анализаторе появится свет. Объясняется тем, что луч света, вышедший из раствора, колеблется в плоскости неперпендикулярной плоскости анализатора. Чтобы вторично достичь темноты, надо повернуть анализатор на соответствующий угол. По углу вращения плоскости поляризации определяют концентрацию анализируемого раствора. Применение метода - на производстве для определения концентрации сахарозы (сахариметры).

3. Фотометрические методы анализа. Все вещества поглощают электромагнитное излучение. Фотометрические методы анализа основаны на измерении интенсивности светового потока, прошедшего через вещество или его раствор.

В зависимости от длины волны, ширины полосы излучения и способа измерения интенсивности светового потока различают следующие фотометрические методы: Колориметрия основана на сравнении интенсивности окраски анализируемого раствора с интенсивностью раствора того же вещества известной концентрации (стандартный раствор). Субъективность визуальных восприятий оттенков и интенсивности окраски является недостатком метода. Фотоэлектроколориметрия основана на измерении интенсивности света в видимой части спектра, для монохроматического света применяются фильтры. Спектрофотометрия основана на измерении интенсивности, как в видимой части спектра, так и в УФ и ИК.

Для монохроматизации света используются дифракционные решетки и призмы. ФЭКМ и СФМ – объективные методы для оценки интенсивности световых потоков применяют фотоэлементы.

Светопоглощение • высчитывается по формуле: Io – интенсивность входящего светового потока It – интенсивность прошедшего светового потока

Оптическая плотность зависит от толщины светопоглощающего слоя, от концентрации растворённого светопоглощающего вещества: A=lg(I 0/It )=k/*l– закон Бугера-Ламберта, где k/ – коэффициент пропорциональности; l – толщина светового слоя, см. Оптическая плотность зависит и от концентрации растворённого светового вещества: A= lg(I 0/It )= k//*С – закон Бугера-Ламберта. k// – коэффициент пропорциональности; С – молярная концентрация растворенного светопоглощающего вещества.

Закон Бера справедлив, если при изменении концентрации вещества не происходит его диссоциация, гидролиз, комплексообразование и другие реакции. В фотометрических методах анализа применяют объединённый закон Бугера-Ламберта-Бера: A=lg ( I 0/It)=k*l*с При концентрации раствора выраженной в моль/л и длина в см коэффициент пропускания называют молярным коэффициентом светопоглощения . Физический смысл : оптическая плотность 1 моль/л раствора измеренная в кювете длиной 1 см.

Закон Бугера-Ламберта-Бера: оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации светопоглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту светопоглощения. – постоянная величина для конкретного вещества; не зависит от концентрации, длины и интенсивности входящего светового потока, но зависит от длины волны. Графическая зависимость оптической плотности A раствора от длины волны света называют спектром поглощения.

Оптическую плотность раствора измеряют фотоэлектроколориметрами (ФЭК). И спектрофотометрами (СФ). Принцип работы ФЭК заключается в том, что световой поток прошедший через кювету с раствором попадает на фотоэлемент , который преобразует энергию света в электрическую энергию, измеряемую микроамперметром.

Работа ФЭК: диафрагму регулируют так, чтобы стрелка микроамперметра отклонялась на всю шкалу до деления 100 (кювета с чистым растворителем). Не изменяя отверстия диафрагмы, помещают кювету с анализируемым окрашенным раствором, при этом стрелка микроамперметра показывает светопропускание (Т, %), который пересчитывают на оптическую плотность. A=-lg T Т=It/Io Для измерения светопоглощения выбирают такую длину волны, при которой возможен минимальный предел обнаружения.

ФЭКи снабжены специальной кассетой со светофильтрами. Применяемый светофильтр должен пропускать лучи такой длины, которые поглощаются анализируемым раствором. Оптическую плотность А анализируемого вещества можно измерить последовательно при всех светофильтрах и выбрать тот, при котором оптическая плотность наибольшая. Аналитические задачи, решаемые фотометрическими методами: 1) Определения, основанные на собственном светопоглощении веществ ( определение кофеина в чае). 2) Определения, связанные с образованием интенсивно окрашенных продуктов при добавлении бесцветного реактива к бесцветному раствору определяемого вещества ( определение белков, нитритов). 3) Определения, основанные на измерении интенсивности окраски избытка окрашенного реактива ( определение сахаров по избытку дихромата калия).

Спектрофотометрия основана на тех же законах светопоглощения, что и фотоэлектроколориметрия. Отличие - возможность проводить измерения оптической плотности как видимой, так и ближней УФ и ИК областях света. Точные результаты получаются, когда оптическая плотность (ОП) примерно равна 0. 4, а если ОП 0. 8 и больше то применяют кюветы с меньшей длиной, если ОП 0. 1 то используют кюветы с большей длиной.

4. Фотонефелометрический (1) анализ и турбодиметрия (2). Эти методы основаны на исследовании свойств мутных растворов. В них применяются одни и те же реакции. Различие состоит в том, что в 1 измеряют интенсивность света рассеянного твёрдыми частицами суспензий, а во 2 - интенсивность света прошедшего через суспензию. При пропускании света через суспензию часть его лучей поглощается, другая часть рассеивается.

Интенсивность рассеянного света подчиняется уравнению Релея: Ir=Io*F*((N*V 2)/(ƛ 4*r 2))*(1+cos 2 B) Io – интенсивность входящего света, Вт/сек*см; F – фактор, зависящий от показателя преломления взвешенных частиц в растворе; N – общее число взвешенных частиц в единице объёма раствора; V - объём взвешенных частиц, см 3; ƛ – длина волны входящего света, нм; r - расстояние от кюветы до наблюдения, см; B – угол между направл. Ir и Io. Если все постоянные обозначить через K: Ir=Io*K*N

Интенсивность рассеянного света пропорциональна концентрации анализируемого раствора. Основная погрешность – трудновоспроизводимый объём взвешенных частиц и изменения этой величины во времени. Для получения воспроизводимых результатов надо строго выполнять условия эксперимента, как приготовлении стандартных растворов, так и непосредственно при количественных определениях. Для стабилизации суспензий в анализируемый раствор вводят защитные коллоиды: крахмал, желатин. 1 -ый метод предназначен для измерения малых концентраций, т. к. при значительном содержании вещества в растворе образуются большие объёмы твёрдой фазы. Такие системы неустойчивы и быстро коагулируют. Для получения суспензий в разбавленных растворах применяются реакции образования малорастворимых осадков (хлориды можно определить). Размеры частиц и свойства суспензий зависят от многих факторов: концентрации определяемого компонента, температуры, времени, прошедшего от смешивания растворов до измерения ИР, присутствия посторонних веществ, порядка смешивания растворов.

Схема фотонефилометра:

5. Фотофлуориметрический метод анализа. Явление флуоресценции (люминесценции) основано на способности атомов или молекул вещества отдавать поглощённую энергию в виде «холодного» светового излучения. Вещество, поглощая свет, излучает световую энергию. Энергия квантов света, выделяющаяся при флуоресценции, всегда меньше энергии квантов поглощённого света. Правило Стокса: спектр флуоресценции смещён в сторону более длинных волн по сравнению со спектром поглощения.

1 – спектр поглощения 2 – спектр флуоресценции

Отношение числа испускаемых при флуоресценции квантов к числу поглощённых квантов называется квантовым выходом Q. Q не зависит от ƛ возбуждающего флуоресценции света. Фотофлуориметрический метод анализа основан на измерении интенсивности флуоресценции, которая зависит от концентрации вещества. При флуоресценции, вызванной наличием микроколичества вещества, соблюдается прямая зависимость между интенсивностью свечения и концентрацией раствора. Если концентрация раствора увеличивается до 10 -4 г/мл, интенсивность флуоресценции постепенно снижается до 0 (концентрационное тушение флуоресценции). С повышением температуры интенсивность флуоресценции снижается (температурное тушение флуоресценции). Интенсивность флуоресценции измеряется на фотофлуориметре.

Схема фотофлуориметра:

Источником УФ излучения является ртутно-квантовая лампа 1, которая излучает и видимые и тепловые лучи. Для поглощения видимого света предназначены светофильтры 2 и 4. Первичный светофильтр 2 поглощает большую часть видимого света, но пропускает УФ лучи, от источника излучения 1, пройдя через светофильтр 2 и попадает в кювету с анализируемым раствором 3. Возбуждаемое в кювете флуоресцентное излучение проходит через вторичный светофильтр 4, задерживающий лучи с =650 нм и поступает на фотоэлемент 5. Для регистрации фотопотока прибор оснащён усилителем 6 и микроамперметром 7. В кювету помещают анализируемый раствор, отмечают показания прибора и заполняют кювету стандартным раствором, затем контрольным раствором, не содержащим определяемого вещества. Во все растворы добавляют необходимые реактивы.

Концентрация анализируемого вещества (Сх мкг/мл): Сх=С(а 1 -а 2)/(а 3 -а 2 ) мкг/мл а 1, а 2, а 3 – показания фотофлуориметра при заполненными кюветами анализируемым, контрольным и стандартным раствором соответственно. С – концентрация стандартного раствора. Различают 2 группы фотофлуоресцентных определений: 1) по собственной флуоресценции вещества (определение тиамина, рибофлавина). 2) на основе реакций, в результате которых из нефлуоресцентного вещества образуется флуоресцирующий продукт ( определение цинка). Практическое применение: широко применяют люминесцентные индикаторы в титриметрических методах.