Тема 13 1 Клеточный цикл Хромосомный цикл Деление

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Общая морфология митотических хромосом. Ультраструктура митотических хромосом. Полиплоидия. Политенные хромосомы. Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре. Отличительные особенности интерфазной хромосомы от митотических. Динамика ядерной оболочки в митозе. Ядрышко во время митоза. Транскрипция на мейотических хромосомах. Хромосомы типа ламповых щеток. Лекция 13(51) 1

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Клеточный цикл • В отличие от клеточного цикла прокариотов эукариотические клетки удваивают число своих хромосом в результате синтеза ДНК задолго до цитотомии, т. е. до разделения исходной клетки на две дочерние. • Время протекания клеточного цикла: бактерии 20— 30 мин, одноклеточные эукариоты (инфузория туфелька) – 10— 20 ч, амеба – около 1, 5 суток, многоклеточные организмы – около суток. • В раннем эмбриогенезе клетки животных организмов делятся часто, у взрослых особей они большей частью теряют эту способность. У круглых червей и коловраток клетки теряют способность к делению после эмбрионального развития, и рост организма, например аскариды, происходит не за счет роста числа клеток, а за счет увеличения их размера. • Клетки различных тканей и органов высших позвоночных имеют неодинаковую способность к делению: полностью теряют свойство делиться большинство, специализированных дифференцированных клеток, например клетки центральной нервной системы. • В организме есть постоянно обновляющиеся ткани – различные эпителии, кровь, рыхлая и плотная соединительные ткани. В них часть клеток делится постоянно (например, клетки базального слоя покровного эпителия, клетки крипт кишечника, кроветворные клетки костного мозга и селезенки), заменяя отработанные или погибающие клеточные типы. • Многие клетки, не размножающиеся в обычных условиях, приобретают вновь это свойство при процессах репаративной регенерации органов и тканей ( например, интенсивно делящиеся камбиальные клетки, дающие начало различным органам и тканям; клетки, возобновляющие деление при регенерации; дифференцированные клетки, в естественных условиях потерявшие способность делиться). Лекция 13(51) 2

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Клеточный цикл • Клетки многоклеточных животных, растений и одноклеточные эукариотические организмы, вступают в процесс деления после ряда подготовительных этапов, важнейшим из которых является синтез ДНК. • Клеточное деление – равномерное распределении редуплицированного генетического материала по двум новым клеткам (т. е. между делениями клеток должен существовать период синтеза ДНК). Это предположение подтверждено в авторадиографических экспериментах с меченными предшественниками ДНК (например, Н 3 тимидин): в гетерогенной популяции клеток, среди которых были как делящиеся, так и неделящиеся клетки, метка включалась только в часть интерфазных клеток). • Через некоторое время после введения метки в образцах встречались как меченые, так и немеченые интерфазные клетки, а также делящиеся клетки, но тоже не содержащие метку. В последних синтез ДНК уже закончился до начала эксперимента. В препаратах, взятых в более поздних стадиях, появлялись меченые делящиеся клетки — это как раз те клетки, которые в момент введения меченого предшественника синтезировали ДНК, были в интерфазе в синтетическом периоде (S период). • Если построить график встречаемости меченых митозов (рис. ), то получится многовершинная кривая: точки между соседними вершинами ограничивают период, соответствующий длительности клеточного цикла, т. е. времени от деления до следующего деления клетки. Рис. Изменение количества меченых митозов в разное время после однократного введения 3 Н тимидина. а – идеальная кривая (1) и кривая, полученная при изучении цикла клеток крипт тощей кишки мыши (2); По оси абсцисс – время, по сои ординат – процент меченных митозов; б – диаграммы в виде круга, обозначающего клеточный цикл и его отдельные фазы Лекция 13(51) 3

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Период интерфазы после S периода, постсинтетический период, принято обозначать, G 2 период. S периоду предшествует пресинтетический, или G 1 период, — отрезок времени до начала синтеза ДНК. • Зная длительность клеточного цикла (Т), по проценту меченых клеток при импульсном введении меченого предшественника можно рассчитать длительность S периода, например, при времени Т, равном 20 ч, до 30% клеток оказываются мечеными 3 Н тимидином, из чего следует, что длительность S периода занимает около 7 ч. • Таким образом, весь клеточный цикл состоит как бы из четырех отрезков времени (периодов): собственно митоза (М), пресинтетического (G 1), синтетического (S) и постсинтетического (G 2) периодов. • Общая продолжительность всего клеточного цикла и отдельных его периодов значительно варьирует не только у разных организмов, но и у клеток разных органов одного организма. Но для клеток одного органа эти величины относительно постоянны (табл. ). • Различные периоды клеточного цикла отличаются друг от друга по общему содержанию в клетках белка, ДНК и РНК и по уровню (интенсивности) их синтеза. Лекция 13(51) 4

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • В G 1 периоде клетки имеют диплоидное содержание ДНК на ядро (2 с), в S периоде содержание ДНК колеблется от 2 с до 4 с, в G 2 периоде содержание ДНК соответствует тетраплоидному (4 с). Следовательно, в однородной популяции клеток (фотометрия ДНК) в интерфазных клетках можно определить, в каком из периодов клеточного цикла находится та или иная клетка (рис. ). Рис. Диаграмма уровней клеточных синтезов в течение клеточного цикла. 1 – содержание ДНК; 2 – интенсивность синтеза ДНК; 3 – интенсивность синтеза РНК; 4 – интенсивность синтеза белка Лекция 13(51) 5

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • В интенсивно делящихся клетках содержание РНК в течение интерфазы увеличивается по крайней мере в 2 раза. После деления в период G 1 вступают дочерние клетки, в которых объем и общее содержание белков и РНК вдвое меньше, чем в сходной родительской клетке. • В это время начинается рост клеток главным образом за счет накопления клеточных белков, что определяется увеличением количества РНК на клетку. В течение всего митоза (от поздней профазы до средней телофазы) синтез РНК в клетке полностью подавлен, поэтому накопление клеточных белков и РНК связано с возобновлением синтеза РНК в начале нового клеточного цикла. • В S периоде уровень синтеза возрастает соответственно увеличению количества ДНК и достигает своего максимума в середине G 2 периода. В конце G 2 пeриода или в профазе синтез РНК резко падает по мере конденсации митотических хромосом и снова полностью прекращается во время митоза. Лекция 13(51) 6

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Синтез белка во время митоза падает до 25% от исходного уровня и затем в последующих периодах достигает максимума в G 2 периоде, в общем повторяя характер синтеза РНК. • Отдельные периоды интерфазы отличаются друг от друга не только общим содержанием и активностью синтезов ДНК, РНК и белка, но и характером синтезируемых РНК и белков. • В растущих тканях растений и животных всегда есть клетки, которые находятся «вне цикла» , не переходят регулярно из G 1 в S, а затем в G 2 и потом в М фазу; такие клетки принято называть клетками Go периода, покоящиеся клетки. • В некоторых тканях клетки могут находиться в Go фазе длительное время, не изменяя особенно своих морфологических свойств: они сохраняют в принципе способность к делению, превращаясь в камбиальные, стволовые клетки (например, в кроветворной ткани). • Чаще потеря способности делиться (хотя бы и временно) сопровождается специализацией, дифференцировкой клеток. Дифференцирующиеся клетки выходят из цикла, но в особых условиях могут снова входить в него. Например, у мышей большинство клеток печени находится в Go периоде. Они не участвуют в синтезе ДНК и не делятся, однако если часть печени удалить, то многие клетки начинают подготовку к митозу (G 1 период), переходят к синтезу ДНК и могут митотически делиться. • В других органах, выходя из клеточного цикла, клетки необратимо дифференцируются и теряют способность к делению: например, нейробласты (эмбриональные нервные клетки) после нескольких циклов клеточного деления теряют способность размножаться, дифференцируются и остаются в этом состоянии до конца жизни организма. • У многоклеточных зрелых организмов большая часть клеток находится в Go фазе. Лекция 13(51) 7

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Хромосомный цикл • Мужские и женские половые клетки несут одинарный набор хромосом и, следовательно, содержат вдвое меньше ДНК, чем все остальные клетки организма. Половые клетки (сперматозоиды и ооциты) с одинарным набором хромосом называют гаплоидными. • Плоидность обозначают буквой n: клетки с 1 n – гаплоидны, с 2 n – диплоидны, с Зn – триплоидны и т. д. Соответственно количество ДНК на клетку (с) зависит от ее плоидности, например, 2 n-клетки содержат 2 с количества ДНК и т. д. . • При оплодотворении происходит слияние двух половых клеток, каждая из которых несет 1 n набор хромосом, поэтому образуется диплоидная (2 n, 2 с) клетка – зигота. • В результате деления диплоидной зиготы и последующего деления диплоидных клеток разовьется организм, клетки которого, кроме половых, будут диплоидными. • Делению клеток предшествует фаза синтеза, редупликации ДНК и количество ДНК в клетках становится 4 с (плоидность 4 n) и после деления такой тетраплоидной (4 с) клетки снова образуются две исходные диплоидные клетки. • В ядрах интерфазных клеток хромосомы находятся в разрыхленном (деконденсированном) состоянии. Хромосомы как нитевидные плотные образуются в начале митотического деления клетки, а именно в профазе (рис. ). Рис. Схема стадий митотического деления клеток. 1 – интерфаза; 2 – профаза; 3 – метафаза; 4 – анафаза; 5 – раняя телофаза; 6 – поздняя телофаза, начало реконструкции ядер Лекция 13(51) 8

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • В профазе каждая из хромосом двойная за счет их редупликации поэтому общее число хромосом в начинающей делиться клетке равно 4 n. Следовательно, уже в начале профазы хромосомы состоят из двух сестринских хромосом, которые называются хроматидами. • В следующем периоде деления клетки – в метафазе – сестринские хромосомы остаются связанными друг с другом в виде пары, выстраиваются в экваториальной плоскости клетки и разъединяются. • В профазе и в метафазе клетки тетраплоидны. • В анафазе каждая из хромосом данной пары расходится к противоположным полюсам клетки, после чего тело исходной клетки делится. • Затем – в телофазе – разошедшиеся диплоидные (2 n) наборы хромосом начинают деконденсироваться (хромосомы теряют четкие очертания). • Перечисленные периоды деления клетки представляют один хромосомный цикл. Лекция 13(51) 9

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Общая морфология митотических хромосом • Хромосомы животных и растений в состоянии наибольшей конденсации (метафаза, начало анафазы) представляют палочковидные структуры разной длины и довольно постоянной толщины. • В хромосоме имеется зона первичной перетяжки – центромера, которая делит хромосому на два плеча (рис. ). • Хромосомы с равными или почти равными плечами называют метацентрическими, с плечами неодинаковой длины – субметацентрическими; палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом – акроцентрическими. • В области первичной перетяжки расположен кинетохор – пластинчатая структура, имеющая форму диска и связанная тонкими фибриллами с телом хромосомы в области перетяжки. Кинетохор в структурном, и функциональном отношении изучен недостаточно. Известно, в частности, что он является одним из центров полимеризации тубулинов; к нему от центриолей отрастают пучки микротрубочек митотического веретена, которые участвуют в движении хромосом к полюсам клетки при митозе. Рис. . Схема общей морфологии метацентрических (1); субметацентрических (2); акроцентрических (телоцентрических) (3); спутничных (ядрышковых) (4). Т – теломеры; Ц – центромеры; ЯО – ядрышковый организатор (вторичная перетяжка) Лекция 13(51) 10

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Обычно каждая хромосома имеет только одну центромеру (моноцентрические хромосомы), но встречаются хромосомы дицентрические и полицентрические, которые имеют соответсвующее число кинетохоров. • В зоне хромосомы, примыкающей к центромере, у многих видов локализована сателлитная ДНК, отличающаяся высоким уровнем повторения нуклеотидных последовательностей. • Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, расположенную вблизи дистального конца хромосомы и отделяющую ее маленький участок – спутник. Вторичные перетяжки называют ядрышковыми организаторами, так как именно на них в интерфазе происходит образование ядрышка. Здесь же локализована ДНК, ответственная за синтез р. РНК. • Плечи хромосом оканчиваются теломерами, конечными участками. Теломерные концы хромосом не способны соединяться с другими хромосомами или их фрагментами, в отличие от концов, лишенных теломерных участков в результате разрывов; последние могут присоединяться к таким же разорванным концам других хромосом. • Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах (рис. ). Рис. Хромосомы разных видов животных. А – речной рак (2 n=196); Б – комар Culex (2 n=6); В – щука (2 n=18); Г – курица; Д – кошка (2 n=38); Е – лошадь (2 n=66); Ж – бык (2 n=60); З – саламандра (2 n=34); И – овца (2 n=54) (по Мюнцингу, 1963) Лекция 13(51) 11

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Длина хромосом может колебаться от 0, 2 до 50 мкм: самые мелкие хромосомы отмечены у некоторых простейших, грибов, водорослей, очень мелкие хромосомы имеют клетки льна и морского камыша (с трудом видны под обычным микроскопом). Наиболее длинные хромосомы обнаружены у некоторых прямокрылых насекомых, у амфибий и у лилейных (рис. ). Длина хромосом у человека в пределах 1, 5— 10 мкм. • Число хромосом различно у разных представителей живого мира, но является характерным для каждого вида животных или растений. У некоторых радиолярий число хромосом достигает 1000 – 1600. Наибольшее число хромосом у растений (около 500) является папоротник ужовник – около 500 , 308 хромосом у тутового дерева, у речного рака 196 хромосом. Наименьшее количество хромосом (1 хромосома на гаплоидный набор) наблюдается у одной из рас аскариды, у сложноцветного Haplopappus gracilis всего 4 хромосомы (2 пары). Рис. Хромосомные наборы аксолотля (а) и вики (б) Лекция 13(51) 12

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Совокупность числа, величины и морфологии хромосом называется кариотипом данного вида. Кариотип является индивидуальной характеристикой хромосомного набора каждого вида. Следовательно, структура кариотипа может быть таксономическим (систематическим) признаком, который начинает использоваться в систематике животных и растений. • На рис. приведена идиограмма (рисунки или снимки хромосом, расположенные в ряд в порядке убывания размера) хромосом даурского хомячка. Видно сходство некоторых из них по длине, по отношению размеров плечей хромосом, в то время как другие хромосомы различаются по своей длине и отношению плечей. • В настоящее время для хромосомного анализа используются методы дифференциального окрашивания хромосом. Например, при обработке препаратов митотических хромосом флуорохромом акрихинипритом во флуоресцентном микроскопе видна исчерченность по длине хромосом: видны поперечные светящиеся полосы (Q полосы, Q окраска), расположение которых характерно для каждой хромосомы. • Дифференциальную окраску хромосом можно провести с помощью нефлуоресцирующих красителей, например, смесью по Гимза (смесь красителей: метилен азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин). Перед окраской препараты обрабатывают разными способами (короткая обработка трипсином, щелочными или кислыми растворами и др. ). • В зависимости от метода окраски можно выявить прицентромерные участки (С полосы, или перевязки) или различные полосы в плечах и теломерах хромосом (G полосы). При этом, так же как при окраске акрихинипритом, расположение полос характерно для каждой хромосомы (рис. ). Рис. Хромосомы даурского хомячка. а – размеры хромосом; б – дифференциальная окраска этих же хромосом Лекция 13(51) 13

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Дифференциальная окраска хромосом связана скорее всего с различной способностью к искусственной деконденсации разных участков хромосом. Так, дифференциальную окраску, соответствующую С и G полосам, можно получить при окраске обычным гематоксилином или наблюдать с использованием фазового контраста на нефиксированных хромосомах в процессе их постепенной деконденсации при удалении двухвалентных катионов из окружающих хромосомы растворов, т. е. наблюдать дифференциальную деконденсацию митотических хромосом. Такая дифференциальная окраска позволила детально изучить строение хромосом человека (рис. ). Рис. Хромосомный набор человека Лекция 13(51) 14

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • При обычных методах окраски весь набор из 46 хромосом человека принято подразделять по их размерам на 7 групп (А, В, С, D, Е, F, G) (рис. ). Если при этом легко отличить крупные (1 я, 2 я) хромосомы от мелких (19 я, 20 я), метацентрические от акроцентрических (13 я), то внутри групп трудно различить одну хромосому от другой. Рис. Кариотип мужчины. Хромосомы обозначены согласно денверовской системе Лекция 13(51) 15

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • В группе С 6 я и 7 я хромосомы морфологически трудно отличимы между собой так же, как и от Х хромосомы. • Дифференциальное окрашивание позволяет четко отличить эти хромосомы друг от друга (рис. ). Рис. Хромосомы мужчины при дифференциальной окраске Лекция 13(51) 16

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Дифференциальная окраска хромосом в сочетании с генетическим анализом позволяет составлять хромосомные карты человека, т. е. находить места расположения генов на определенных участках хромосом (рис. ). (Методы окраски хромосом детально описаны в кн. Методы генетики соматических клеток, т. 2, гл. 34) Рис. Генетическая карта хромосомы 1 человека. Отдельные гены локализованы в определенных сегментах хромосомы. 1 – группа крови Сцианна, группа крови Do, фосфопируват дегидрогеназа; 2 – фосфоглюконатдегидрогеназа, эритроцитарная группа крови резус (Rh), аденилатциклаза локус 2; 3 – фосфоклюкомутаза локус 1; 4 – уридин моно фосфаткиназа , эллиптоцитоз I, α амилаза слюны, α амилазапанкреотическая, группа крови Даффи и др. ; 5 – глюкозо 1 фосфатуридинтранфераза, катаракта; 6 – пептидаза С; 7 – 5 S РНК гены; 8 – фумаратгидратаза; 9 – гуанилат циклаза, место для аденовируса 12, α фруктозидаза Лекция 13(51) 17

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Ультраструктура митотических хромосом • Хромосома оказалась слишком мала для детального анализа с помощью светового микроскопа и слишком велика и плотна для изучения в электронном микроскопе. • Для изучения ультраструктуры хромосом применяется метод получения целых выделенных митотических хромосом после разрушения клетки, например, в гипотонических растворах солей (концентрация которых ниже, чем в клетке). В этих условиях клетки, набирая воду, набухают, и достаточно небольшого механического усилия, чтобы их плазматическая мембрана разрушилась. Из образовавшегося клеточного гомогената легко выделить хромосомы. • В состав хромосом входят 25 – 30 нм элементарные фибриллы и хромосомы имеют вид тел, состоящих как бы из перепутанных изгибающихся фибрилл. • Определить число фибрилл в составе хромосомы и порядок укладки одной фибрилы от начала до конца, если бы она была основой хромосомы практически невозможно (рис. ). • Необходимо учитывать, что процесс выделения хромосом приводит к изменению их структуры. Например, при переносе живых делящихся клеток в гипотонические растворы их хромосомы резко набухают (световой микроскоп). При этом они становятся плохо различимы, увеличиваются в объеме, их оптическая плотность уменьшается (аналогично изменениям в препаратах выделенного хроматина – набухание и переход в менее конденсированное состояние). Рис. Вид выделенной метафазной хромосомы • Действие гипотонической среды приводит к потере субструктуризации хромосомы. Лекция 13(51) 18

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Одним из промежуточных уровней компактизации хроматина может быть хромомерный уровень. Хромомеры хорошо выявляются в интерфазных политенных хромосомах, в мейотических хромосомах. Они видны в электронном микроскопе при искусственной деконденсации хроматина, ядра и митотических хромосом (см. тему 11). • При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромосом необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина. Хромонему – нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0, 1— 0, 2 мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в телофазе. Такие хромонемы выявляются в клетках как растений, так и животных. • Процесс конденсации хромосомного материала в профазе включает в себя промежуточный этап: образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур, являющихся единицей последующей хромосомной структуризации, • В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно видеть признаки хромонемной организации хромосом (рис. ). • В поздней анафазе, когда хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной около 0, 2 мкм. При этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей деконденсации митотических хромосом. Рис. Хромосомы на ультраструктурных срезах. а – профазные хромосомы пиона; б – телофазные хромосомы клеток культуры ткани 19 Лекция 13(51)

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Начальная стадия деконденсации связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением, обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и выраженным этот процесс становится в телофазе: хромосомы увеличиваются в объеме и расстояние между отдельными участками хромонемы возрастает. • В расположении отдельных нитей хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, наблюдаются признаки спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые участки, иногда располагающиеся параллельно другу. • Спиральность хромонемы в составе митотических хромосом наблюдается в ряде случаев при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических хромосом (рис. ). • В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены ядерной оболочкой, хромонемные элементы расходятся на значительные расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время некоторые участки хромонем начинают разрыхлиться, их толщина возрастает. • Таким образом, последовательность изменений структуры и расположением хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе противоположна той, что наблюдается в профазе: разрыхление хромосом за счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их разрыхления, деконденсации самих хромонем. Рис. Спиральность выделенных хромосом после обработки 0, 6 М KCl Лекция 13(51) 20

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • После гипотонических обработок хромосом появляется продольная неоднородность в структуре хромосом (неоднородности, или «бэндинги» ), которая отсутсвтует в нативных (без гипотонической обработки) хромосомах даже в электронном микроскопе. • Обратимое изменение объема митотических хромосом при изменении ионного окружения (в гипотонических растворах хромосомы набухают, но при возвращении их в изотонические условия они вновь приобретают исходную морфологию) показывает, что существует какой то механизм, стабилизирующий общую организацию хромосомы. • Обнаружено, что хромосомы не теряют своей морфологической целостности даже при резком набухании, вызванном удалением всех гистонов. При обработке выделенных хромосом растворами полианионов, декстрансульфата и гепарина хромосомы настолько деконденсируются, что перестают быть видны в фазово контрастном микроскопе. При добавлении флуорохрома, связывающегося с ДНК (этидиум бромид) сильно набухшие хромосомы не развались, а значительно (до 4 раз) увеличивались в длину и ширину. Лекция 13(51) 21

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Разрыхленные хромосомы состоят из двух компонентов: рыхлой сети плотных фибрилл в центральных участках, повторяющих контуры метафазных хромосом (осевые компоненты), и многочисленных длинных тонких петель, отходящих от них в поперечном направлении (рис. ). Показана белковая природа осевых компонентов и ДНК в составе петель. • Средний размер боковых петель составлял около 30 мкм. Если такие препараты обработать ДНКазой, то можно получить белковые остовы и анализировать их состав. Оказалось, что в них присутствует около 20 белков негистоновой природы, сходных с белками ядерного матрикса. • Исходя из этого, была предложена модель структурной организации митотических хромосом. В ее основе лежит принцип поперечного расположения петель ДНК вдоль белковой осевой структуры. Такой тип организации митотической хромосомы в целом, очень напоминает хромосомы типа «ламповых щеток» , встречающиеся в процессе мейоза. • Установлено петлистое расположение ДНК вдоль хромосомы. Однако при разных способах депротеинизации кроме петель в периферии набухших хромосом выявляются и розеткоподобные структуры, состоящие из ДНК. Рис. Латеральные петли ДНК и осевые компоненты метафазной хромосомы после полной экстракции гистонов Лекция 13(51) 22

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Получены данные о том, что осевые структуры могут быть артефактом, в результате монтажа и высушивания дегистонизированных хромосом на подложке. • Реально в теле хромосомы есть негистоновые белковые связи (скрепки), сшивающие основания боковых петель ДНК, но эти связки разбросаны рыхло по объему хромосомы (рис. 1). • Принцип петлевой поперечной укладки ДНК в теле хромосомы очень важен для понимания ее ультраструктурной организации. • На поперечных и продольных сечениях митотических хромосом, фиксированных в нативном состоянии, никаких центральных или осевых элементов не обнаружено. Они выявляются только после удаления из выделенных хромосом всего набора гистонов, чему предшествует изоляция хромосом в гипотонической среде. • На основании указанных наблюдений широко распространена схема, объясняющая структуру митотической хромосомы (рис. 2). Рис. 1. Схема возможного расположения петель ДНК (1) и белковых «скрепок» (2), связь между которыми определяют параметры хромосом • Согласно этой схеме первым уровнем компактизации ДНК является нуклеосомная фибрилла толщиной 10 нм. Вокруг одной нуклеосомы, оборачивается 146 н. п. ДНК с коэффициентом компактности (к. к. ), равным 6 – 7; второй уровень – 30 нм фибрилла соленоид (к. к. = 40); третий уровень – петлевой домен, 60 тыс. н. п. на петлю в 0, 2 – 0, 3 мкм (к. к. = 680). Далее отрезок примерно с 18 – 20 петлевыми доменами образует вокруг осевого элемента хромосомы один виток диаметром 0, 7 – 0, 8 мкм (толщина хроматиды) с коэффициентом компактизации 12 104. Такой виток из петлевых доменов может Рис. 2. Схема уровней представлять собой минимального размера организации хроматина бэнда, а набор из нескольких витков – средний бэнд. 23 Лекция 13(51)

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Как уже указывалось, набухание хромосом можно вызвать простым понижением концентрации Са 2+ или Mg 2+ в растворах. Оказалось, что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется, благодаря чему выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы представлены сечениями толстых (0, 1 – 0, 2 мкм) хромосомных нитей – хромонем (рис. ). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных катионов происходит как бы распад хромонемных элементов на множество линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром 0, 1 – 0, 2 мкм. В дальнейшем эти блоки (хромомеры) начинают дсконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Рис. Структура дифференциальной деконденсации хромосом. ЦМ – центромера; ЯОР – ядрышковый организатор; G, R сегменты хромосомы; ХМ – хромомеры; ХН хромонема Лекция 13(51) 24

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с рисунком G полос хромосом. По мере дальнейшей деконденсации петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомера прогрессивно уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на срезах равномерно расположенными фибриллами ДНП. • Необходимо отметить, что в последнюю очередь, да и то не полно, деконденсируются центромерные участки гетерохроматина. Участки, аналогичные G полосам, претерпевают этапы деконденсации при меньших концентрациях двухвалентных катионов, чем эухроматические зоны хромосом, которые набухают раньше всех. • Исходя из этих наблюдений можно предположить, что петле ДНК, выявляемой на хромосомах, лишенных гистонов, соответствует хромомер, промежуточным этапом деконденсации которого является розеткоподобная структура ДНП. • Хромомерные участки ДНП встречаются и в интерфазных ядрах (там они называются хрсмоцентрами). Порядок их деконденсации такой же, что и в митотической хромосоме: из хромоцентров возникают розеткоподобные структуры с петлями ДНП по их периферии. В состав таких розеток входит 40 – 70 тыс. н. п. , как и в состав хромомеров политенных хромосом. Хромомеры последних при понижении концентрации Са 2+ претерпевают те же превращения, что и хромомеры митотических хромосом. Лекция 13(51) 25

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Этапы компактизации ДНК, которые приводят в конце концов к построению плотного тела митотической хромосомы, показаны на рис. Рис. Схема различных уровней компактизации хроматина. 1 – нуклеосома; 2 – нуклеомер, «сверхбусина» ; 3 – хромомер, петлевой домен; 4 – хромонема; 5 хроматида Лекция 13(51) 26

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Первый уровень – нуклеосомный – образует сверхскручивание ДНК по поверхности гистоновой сердцевины. • Второй уровень – нуклеомерный (сверхбусина), где идет объединение 8 – 10 нуклеосом в виде глобулы. Так как все эти уровни компактизащш происходят на огромных линейных молекулах ДНК, то ряд сближенных нуклеомеров и образует 20 – 30 нм фибриллу ДНП. • Третий уровень – хромомерный: петли фибрилл ДНП, объединенные скрепками из негистоновых белков, образуют компактные тела, которые при искусственной деконденсации дадут розетковидные структуры. • Четвертый уровень – хромонемный: сближенные в линейном порядке хромомеры образуют толстые (0, 1 – 0, 2 мкм) хромосомные нити, которые можно уже наблюдать и в световом микроскопе. Характер упаковки этой нити в теле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование ею и еще одного уровня петлистых структур. • Приведенная общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков, таких, как ядрышковый организатор, теломеры и центромеры. Лекция 13(51) 27

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Полиплоидия • Количество ДНК, приходящееся на ядро эукариотической клетки, зависит еще от одной характеристики – плоидности, при которой может меняться не только содержание ДНК, но и структура интерфазных ядер. • Полиплоидия – это кратное гаплоидному (1 n) количеству увеличения ДНК и соответственно хромосом на ядро. • Существуют естественные ряды полиплоидных растений. Полиплоидные особи могут быть получены экспериментально, например путем нарушении процесса деления клеток. При этом после репликации ДНК до уровня 4 с клетки снова вступают в S пeриод. • Среди почти всех многоклеточных эукариотов есть организмы, у которых часть соматических клеток могут быть полиплоидными. Количество ДНК у них обычно в четное количество раз выше, чем в клетках с диплоидным набором хромосом (4 с, 8 с, 16 с, 32 с и т. д. ). • Одной из характерных черт таких полиплоидных клеток будет прогрессивное падение их способности к митозу. Более того, все они возникают вследствие нарушения именно этого процесса. Поэтому чаще всего соматическая полиплоидия регистрируется не по числу хромосом, а по количеству ДНК в данной клетке. • Например, в меристеме корней конских бобов (Vicia faba) встречаются клетки с количеством ДНК 8 с (октоплоидные), а кукурузы — с 16 с. Известны объекты и с огромным содержанием ДНК: в ядрах клеток подвесок фасоли количество ДНК в 8192 раза больше, чем в гаплоидном ядре. Соответственно увеличению ДНК увеличивается и объем таких интерфазных ядер. Так, размер полиплоидных ядер в подвесках фасоли достигает 60 мкм. Лекция 13(51) 28

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Полиплоидия встречаются у безпозвоночных животных. Например, у личинок двукрылых в ядрах гигантских клеток так называемой слюнной железы обнаруживается огромное количество ДНК: например, у Drosophila melanogaster – 512 с, у Chironomus tentants – 16384 с. В пищеводной железе аскариды их содержится 30 – 260 тыс. с, в нейронах аплизии – 260 тыс. с, в шелкоотделительной железе шелкопряда – 500 тыс. с (!). • Часто полиплоидные клетки встречаются и у позвоночных животных, особенно у млекопитающих. Например, в ядрах клеток печени мышей количество ДНК может достигать 4 – 32 с, в ядрах миокардиоцитов – 8 с, мегакариоцитов – 8 – 64 с, трофобластов плаценты крысы – 4096 с (!). • Полиплоидные клетки возникают также в результате нарушений процесса митоза. Один из путей соматической полиплоиди – выпадение конечных фаз митоза при так называемом полиплоидирующем митозе. При этом, когда клетки с тетраплоидным количеством ДНК вступают в митоз, их хромосомы расходятся на две группы, но деления тела клетки не происходит (рис. ). Рис. Образование двуядерных и полиплоидных клеток паренхимы печени Лекция 13(51) 29

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Каждая группа хромосом одевается ядерной оболочкой, и в клетке возникают два диплоидных интерфазных ядра (2 nх2). Сама же клетка по определению остается тетраплоидной. Через некоторое время она вступает в S период, в результате чего в ней будут содержаться уже два тетраплоидных ядра (4 nх2), и клетка станет октоплоидной. После этого клетка снова вступает в митоз, ее хромосомные наборы объединяются, и она делится полностью на две дочерние, каждая из которых становится одноядерной тетраплоидной (4 с ДНК). • Такое образование полиплоидных клеток может многократно повторяться, что в ряде случаев приводит к появлению клеток, где количество ДНК возрастает до 64 с, как у мегакариоцитов. Эти клетки имеют огромные многолопастные ядра. Так, в частности, возникают полиплоидные клетки печени, кардиомиоцитов, эпителия мочевого пузыря и др. • Таким образом, при полиплоидирующем митозе происходит несколько раундов репликации ДНК с выпадением нескольких раундов цитотомии, что приводит к прогрессивному увеличению количества ДНК на ядро. Лекция 13(51) 30

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Второй способ полиплоидизации клеток связан с полным выпадением митоза при следующих друг за другом раундах репликации ДНК. В этом случае цикличность событий можно представить себе так: G→S→G→S→ и т. д. При этом последовательно нарастает количество ДНК: 2 с – 4 с – 8 с – 16 с – и т. д. Так возникают гигантские ядра трофобластов плаценты (4096 с, что соответствует 10 циклам редупликации), гигантские ядра слюнных желез двукрылых (16384 с – 12 циклов репликации), огромные ядра клеток шелкоотделительной железы шелкопряда (около 500000 с, что соответствует результату 18 – 20 циклов репликации). • Такой тип полиплоидизации получил название процесса политении – многонитчатости. Впервые он был описан и подробно исследован на слюнных железах двукрылых. • В результате двух процессов – многократной репликации нитчатых интерфазных хромосом и их нерасхождени – постепенно возникают все утолщающиеся продольные многонитчатые структуры – политенные хромосомы (рис. 1, 2). Такой тип политении характерен для двукрылых насекомых и некоторых инфузорий (стилонихия). Рис. 1. Схема образования политенной хромосомы (А). А – нить интерфазной хромо сомы с участками конден сировнного хроматина; б – две нити после редупликации; в – 8 сближенных нитей в результате трехкратной редкпликации хромосом. Б – строение участка политенной хромосомы. 1 – диски; 2 – междисковые участки; 3 – пуф, образовавшийся за счет деконденсации хроматина диска Рис. 2. Набор политенных хромосом из гигантских клеток слюнных желез дрозофилы (А) в сравнении с размером митотических хромосом в делящихся клетках (Б) Лекция 13(51) 31

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Другой тип политении – образование рыхлых пучков нитчатых реплицированных хромосом, которые могут держаться вместе за счет объединения их в районы гигантских хромоцентров (прицентромерные районы). Число хромоцентров показывает, что в ядре имеется диплоидное число многократно реплицированных хромосом. • Такие политенные ядра характерны, например, для гигантских клеток трофобласта плаценты грызунов и гигантских ядер антипод злаковых растений (рис. ) • Количество ДНК в ядрах может достигать многих тысяч гаплоидных единиц, как, например, в шелкоотделительной железе шелкопряда. В этих огромных ядрах не видно ни нитчатых политенных хромосом, ни пучков связанных вместе хромосомных нитей, но отчетливо видны крупные хромоцентры, число которых равно числу хромосом. Это позволяет считать, что в данном случае реплицированные интерфазные хромосомы объединены друг с другом, но в более рыхлой форме. Рис. Политенные хромосомы в ядре антипод Dicentra spectabilis Лекция 13(51) 32

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Наконец, во многих случаях в полиплоидных гигантских ядрах не видно признаков нерасхождения или объединения реплицированных хромосомных нитей – скрытая политения. Ядра выглядят диффузными, в них нет четко регистрирующего числа хромоцентров или хромосомоподобных структур. Так организованы гигантские нейроны моллюсков и гигантские клетки пищеводной железы аскариды. • Полиплоидия – явление широко распространенное. У млекопитающих, в частности, очень велико число полиплоидных (одно или двухъядерных) кардиомиоцитов (60— 80%). Биологический смысл соматической полиплоидии, по видимому, заключается в повышении функциональной мощности клеток при увеличении общего числа генов, в том числе и генов тканеспецифических функций. Так, в полиплоидных клетках соответственно увеличению ДНК возрастает транскрипционная активность, увеличен, по сравнению с диплоидными клетками, синтез белка. Лекция 13(51) 33

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре • Представление о том, что митотические хромосомы после деления клеток превращаются в хроматин интерфазного ядра, не теряют своей целостности (не распадаются на фрагменты), а сохраняют индивидуальность, переходя в разрыхленное, деконденсированное состояние, было высказано Т. Бовери еще в 1887 г. • Эти представления получили название теории непрерывности хромосом, которая гласит: хромосомы, вошедшие в состав дочернего ядра в телофазе, сохраняются в нем хотя бы и в очень измененном виде в качестве индивидуальных структур и появляются снова в собственном смысле слова в следующей профазе. • Основой для этого вывода послужило наблюдение Т. Бовери за поведением хромосом в дробящихся яйцах одного из видов аскариды (Ascaris megalocephala univalens), в клетке которой всего две хромосомы. Было обнаружено, что в профазе первых двух делений зиготы хромосомы вновь обнаруживаются на местах бывших телофазных хромосом предыдущего деления, повторяя их форму и локализацию (рис. ). Рис. Морфологическое постоянство хромосом в первых делениях дробления аскариды. а – первое деление, поздняя анафаза; б – то же, ранняя телофаза; в – интерфаза; г – профаза второго деления; видно сходство в расположении хромосом в б, в и г Лекция 13(51) 34

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Наблюдения Т. Бовери не могут служить прямым доказательством теории, но являются основой для высказывания предположения о судьбе хромосом в клеточном цикле. Существует также серия косвенных данных, подтверждающих теорию непрерывности хромосом. Вот некоторые из них. • В интерфазных ядрах целого ряда объектов удается регистрировать отдельные специфические участки, аналогичные по своим свойствам теломерам и центромерам митотических хромосом. Так, например, у некоторых луков все хромосомы имеют постоянно конденсированные участки на теломерах (рис. ). Рис. Полярное периферическое расположение теломерных хромоцентров (стрелки) в телофазных ядрах меристемы корешка A. fistulosum Лекция 13(51) 35

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Теломеры митотических хромосом обладают свойством окрашиваться как С сегмент. В интерфазных ядрах указанных видов также обнаруживаются С положительные зоны. Их количество вдвое меньше, чем число плечей митотических хромосом, вероятно, за счет того, что в интерфазе теломерные участки соседних хромосом могут ассоциировать друг с другом. В интерфазном ядре такие участки располагаются в одном из полюсов, как бы повторяя теломерную ориентацию хромосом в митозе. • Подобным же образом можно наблюдать в интерфазных ядрах центромерные участки хромосом, например, у мыши центромеры всех акроцентрических хромосом интенсивно окрашиваются по методике выявления С сегментов (рис. ). Таким же свойством обладают связанные с периферией ядра плотные участки интерфазного хроматина – хромоцентры. Показано, что эти участки по своей молекулярной композиции аналогичны центромерным участкам митотических хромосом. Рис. С окраска центромерных районов метафазных хромосом и интерфазного ялра клеток культуры мыши Лекция 13(51) 36

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Наконец, в интерфазных клетках можно наблюдать целые отдельные хромосомы; например, одну из Х хромосом самок млекопитающих. Правда, по морфологии такие целиком конденсированные хромосомы (тельца Барра) отличаются от митотических хромосом, но по объему и количеству ДНК полностью соответствуют Х хромосоме в митозе. • У пашенной полевки (Microtus agrestis) обе половые хромосомы могут целиком интенсивно окрашиваться по С методике. В интерфазных ядрах различных клеток этого животного можно с помощью той же окраски видеть два больших блока, интенсивно окрашенного хроматина. • Первые исследования о порядке расположения хромосом внутри ядра принадлежит К. Раблю (1885), который, изучая профазные ядра растений, предположил, что внутри ядра хромосомы повторяют свою анафазную ориентацию (центромеры на одном полюсе, теломеры – на другом) в течение всего клеточного цикла. • Особенно демонстративно расположение хромосом в интерфазном ядре было показано при изучении пространственной локализации политенных хромосом. С помощью 3 х мерной компьютерной реконструкции изображений серийных срезов, удалось создать объемную реконструкцию интерфазного ядра и проследить в его трехмерном пространстве каждую из четырех гигантских политенных хромосом (рис. ). Рис. Трехмерная реконструкция топографии политенных хромосом в ядре слюнной железы дрозофилы. Т – теломеры хромосом; Ц – центромеры Лекция 13(51) 37

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Было обнаружено, что в объеме ядер хромосомы располагаются, повторяя анафазную ориентацию (так называемую «ориентацию по Раблю» ). При этом каждое плечо хромосомы занимает определенную зону, не перекрывая друга, хотя они расположены довольно тесно. Каждая из хромосом образует пологую правую спираль (5 – 7 витков), которая в нескольких (1 – 4) местах связана с ядерной оболочкой, как бы фиксируется на ней. Фиксированы на ядерной оболочке и теломерные участки всех хромосом, которые располагаются на одном из полюсов интерфазного ядра. На противоположном полюсе ядра также в связи с ядерной оболочкой располагаются центромерные районы хромосом, часто объединенные в один хромоцентр – крупный блок интерфазного хроматина. • Суммируя общие представления о формах организации хромосом, можно прийти к заключению, что они могут находиться в двух альтернативных морфологических состояниях: 1) максимально конденсированное, компактное, метаболически неактивное, транспортное состояние, предназначенное для того, чтобы в минимальном объеме без структурных нарушений перенести во время клеточного деления огромные по длине молекулы ДНК; 2) деконденсированное, при котором линейная длина развернутых хромосом увеличивается в десятки, а иногда и в сотни раз. Это метаболически активное состояние, связанное с синтезом ДНК и РНК. Лекция 13(51) 38

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Отличительной особенностью интерфазной хромосомы от митотических кроме всего прочего является то, что по своей длине она может быть деконденсирована, развернута неравномерно: наряду с участками полной деконденсации есть участки, находящиеся в плотном, конденсированном и соответственно в неактивном состоянии. Это и придает интерфазному ядру своеобразную структуру, где хроматин (интерфазная хромосома) может быть представлен то плотными блоками, то рыхлыми деконденсированными участками (рис. ). Рис. Схема пространственного расположения интерфазных хромосом. Т – теломерные и Ц – центромерные участки хромосом Лекция 13(51) 39

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Динамика ядерной оболочки в митозе • Большей частью, но не у всех видов (исключение составляют амёбы, эвгленовые, инфузории, динофлагелляты, многие водоросли, некоторые грибы), ядерная оболочка разрушается при митозе и снова возникает после деления клеток. • Это так называемый открытый тип митоза (рис. ). При этом в профазе по мере конденсации хромосом ядерная оболочка теряет с ними связь, а затем в ней появляются разрывы. Она приобретает вид плоских мембранных вакуолей – цистерн. В это время ядерные поры еще видны. • Позднее поры исчезают, а ядерная оболочка превращается в скопление мелких мембранных пузырьков, окружающих зону бывшего интерфазного ядра. Такие пузырьки морфологически нельзя отличить от других мелких вакуолей в цитоплазме. • В метафазе около хромосом или в контакте с ними мембранные элементы практически не встречаются. Поэтому нет оснований считать, что хромосомы обязательно должны участвовать в переносе мембран ядерной оболочки. Более того, в метафазе мембранные элементы цитоплазмы оттесняются к периферическим зонам клетки микротрубочками веретена деления. Рис. Поведение ядерной оболочки при митозе животной клетки (по Зацепиной и др. , 1976). 1 – интерфаза; 2, 3 – профаза; 4 – прометафаза; 5 – метафаза; 6 – анафаза; 7 – телофаза; 8 – реконструкция дочерних ядер; хромосомы в профазе теряют коньтакт с ядерной оболочкой и в конце анафазы вступают в объединение с Лекция 13(51) 40 мембранами цитоплазмы.

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • В конце анафазы, когда прекращается движение хромосом к противоположным полюсам клетки, мембранные пузырьки цитоплазмы, в первую очередь мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума, начинают контактировать с поверхностью хромосом. Эти контакты происходят сначала в небольшом числе точек, но затем начинаются перестройка и рост этих первичных зачатков ядерной оболочки. Они из мелких пузырьков превращаются в плоские вакуоли, которые растут в ширину и обволакивают поверхность деконденсирующихся хромосом. Участки таких растущих плоских мембранных мешков сливаются, замыкая и отгораживая содержимое нового интерфазного ядра. Интересно, что ядерные поры появляются на самых ранних этапах реконструкции ядерной оболочки, когда двойные мембранные цистерны еще не сомкнулись и фактически ничего не разделяют. • У некоторых низших организмов в случае закрытого митоза ядерная оболочка не исчезает. Она замыкается в зоне ядерной перетяжки, что приводит к образованию двух новых ядер. Здесь участие ядерной оболочки в делении клетки заключается в том, что на ней закреплены хромосомы, и она, по видимому, участвует в индукции образования микротрубочек, необходимых при делении клеток. • По видимому, для реконструкции ядерной оболочки необходимым условием является деконденсация хромосом. Если вызвать преждевременную деконденсацию метафазных хромосом, то они очень быстро контактируют с мембранными пузырьками и каждая одевается своей собственной ядерной оболочкой. Вследствие этого в клетке образуется множество так называемых микроядер, каждое из одной хромосомы. Лекция 13(51) 41

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Разборку ядерной оболочки у интерфазного ядра можно вызвать экспериментально. Это происходит при сливании в культуре ткани двух клеток на разных стадиях клеточного цикла: получается так называемый гетерокарион, где одно из ядер будет находиться в интерфазе, а другое – в виде митотических хромосом в метафазе. В этом случае в интерфазном ядре начинает конденсироваться хроматин, образуются преждевременно конденсированные хромосомы, а ядерная оболочка исчезнет, так же как во время нормального митоза (рис. ). • Эти данные показывают, что в цитоплазме митотической клетки существуют какие то факторы, вызывающие как конденсацию хромосом, так и параллельный процесс распада ядерной оболочки. • Аналогичная динамика совпадения процессов перестройки хромосом и ядерной оболочки наблюдается и в другой системе – в цитоплазме ооцитов или в бесклеточных цитоплазматических экстрактах ооцитов: если в цитоплазму ооцита амфибий на стадии метафазы инъецировать выделенные интерфазные ядра, то их ядерная оболочка разбирается, а хроматин конденсируется в виде митотических хромосом. Если же в ооцит на стадии интерфазы ввести митотические хромосомы, то они начинают деконденсироваться, вокруг них появляются множественные мелкие вакуоли, которые, сливаясь друг с другом, образуют ядерные оболочки. • В цитоплазму интерфазного ооцита можно ввести даже чужеродную чистую ДНК, которая, связываясь с гистонами в цитоплазме, образует хроматиновые глыбки, которые в свою очередь одеваются ядерными оболочками и превращаются в микроядра. Рис. Преждевременная конденсация хромосом и растворение ядерной оболочки в гетерокарионе. 1 – митотические хромосомы донорской клетки; 2 – ядро клетки реципиента Лекция 13(51) 42

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Приведенные экспериментальные приемы вместе с методом иммунофлуоресценции позволили проследить судьбу многих белков ядерной оболочки во время митоза. Подробно изучена судьба, ламинов. Было найдено, что фиброзный слой ламинов деполимеризуется параллельно распаду ядерных мембран и конденсации хроматина. Этому предшествует обильное (в 7 раз выше, чем в интерфазе) фосфорилирование ламинов. Ламины А и С деполимеризуются до димеров и тетрамеров и, переходя в растворимое состояние, равномерно распределяются в цитоплазме вне связи с другими структурами. Ламин В тоже деполимеризуется до олигомеров, но остается связанным с мембранными пузырьками, возникшими из ядерной оболочки. • Судьба комплексов пор в раннем митозе не ясна. Многие белки ядерных пор, например белок gp 190, равномерно распределены по цитоплазме метафазных клеток, однако не ясно, входят ли они в состав структуры перового комплекса или же поровые комплексы полностью диссоциируют. • При сборке ядерной оболочки в телофазе белки ламины начинают выявляться в центромерных и теломерных участках хромосом (иммунохимия). Там же обнаруживаются первые признаки образования новой ядерной оболочки и скапливаются антитела к белкам порового комплекса. • В бесклеточной системе цитоплазматического экстракта ооцитов ассоциация растворимых в митозе ламинов А и С происходит независимо от ламина В. Оказалось, что если систему реконструкции ядерной оболочки лишить ламина В, то ламины А и С связываются с поверхностью хромосом, но сборки ядерной оболочки не происходит. В экстракте, лишенном ламинов А и С, ламин В связывается с хромосомами, но нормальная ядерная оболочка также не формируется. Лекция 13(51) 43

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Ядрышко во время митоза • Ядрышко выявляется во время интерфазы, в митотических клетках оно исчезает. • При использовании цейтраферной микрокиносъемки можно наблюдать в живых клетках, как по мере конденсации хромосом ядрышко в профазе исчезает. Сначала оно слегка уплотняется, но затем ко времени разрыва ядерной оболочки начинает быстро терять плотность, становится рыхлым и на глазах быстро исчезает, как бы тает. • При этом видно, что часть ядрышкового материала растекается между хромосомами. В метафазе и анафазе ядрышки как таковые отсутствуют. • Первые признаки новых ядрышек появляются после средней телофазы, когда уже достаточно разрыхлились хромосомы дочерних ядер, имеющие новую ядерную оболочку. В это время вблизи деконденсирующихся хромосом появляются плотные тельца – предъядрышки. Обычно их число выше, чем в интерфазе. • Позднее, уже в G 1 периоде клеточного цикла предъядрышки растут, начинают объединяться друг с другом, их общее число падает, но суммарный объем возрастает. Общий объем ядрышка удваивается в S – G 2 фазах. В некоторых случаях в профазе (в культуре клеток человека) при конденсации хромосом крупные ядрышки распадаются на более мелкие, которые в митозе исчезают. Лекция 13(51) 44

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • На самом деле полного исчезновения, или «растворения» , ядрышка нет: происходит изменение его структуры, редукция одной части его компонентов при сохранении другой. Так, было показано, что аргентофильные гранулы в интерфазных ядрышках, обнаруживаемые в световом микроскопе, начинают в профазе сливаться друг с другом, одновременно уменьшаясь в объеме, минимальный размер они занимают в метафазе, локализуясь в зонах ядрышковых организаторов хромосом. В таком виде они существуют до средней телофазы, когда выявляются в виде отдельных множественных предъядрышек, разбросанных среди деконденсированных хромосом. • В конце телофазы такие аргентофильные предядрышки начинают расти. Таким образом, можно видеть, что во время митоза исчезновению подвергается только часть ядрышкового компонента, в то время как аргентофильный компонент сохраняется, постоянно существует во время митоза и переносится на хромосомах в дочерние ядра. • Авторадиографическими исследованиями было показано, что исчезновение ядрышек совпадает с прекращением синтеза клеточной, в основном р. РНК, который возобновляется в поздней телофазе, совпадая по времени с появлением новых ядрышек. • Кроме того, было обнаружено, что активность РНК полимеразы I также исчезает на средних стадиях митоза. Это давало основание считать, что новообразование ядрышек связано с восстановлением синтеза р. РНК в дочерних клетках. • Однако существуют факты, указывающие на перманентное, постоянное присутствие ядрышковых компонентов в течение всего клеточного цикла. Это относится к Ag фильному материалу ядрышек в первую очередь. Кроме того, с помощью иммуноцитохимических методов было показано, что антитела к РНК полимеразе I связываются как с интерфазными ядрышками, так и с ядрышковыми организаторами митотических хромосом, в которых этот фермент пребывает, вероятно, в неактивной форме. Лекция 13(51) 45

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Интересное распределение во времени деления имеют характерные для ядрышек белки В 23 и С 23. С помощью иммунохимических методов было показано, что в профазе начинается перераспределение этих белков: оба они начинают выявляться в кариоплазме, а белок В 23 располагается по поверхности многих хромосом, но вне связи с ядрышковыми организаторами. • В метафазе и анафазе такой тип распределения белков сохраняется. Белок С 23 с помощью этого метода в ядрышковых организаторах в метафазе выявляется с трудом (вероятно, это связано с модификацией этого белка, меняющей его антигенные свойства). Однако позже в телофазе белок С 23 локализуется исключительно в проядрышках, в то время как белок В 23 начинает по мере деконденсации хромосом выявляться в кариоплазме. В G 1 периоде наблюдается интенсивная флуоресценция белка С 23 и более слабая В 23 в новообразующихся ядрышках. • Из этих экспериментов становится ясным не только то, что часть ядрышковых белков (В 23) может терять связь с ядрышком при его профазном исчезновении, но и то, что эти белки могут переноситься хромосомами (вне районов ядрышковых организаторов) в дочерние ядра, где они обнаруживаются в новых ядрышках. Такое поведение ядрышек, выявляется на уровне светового и электронного микроскопа. Лекция 13(51) 46

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Редукция ядрышка в профазе включает два процесса: разрыхление и утрату гранулярного компонента параллельно с утратой плотного фибриллярного компонента и объединением множественных фибриллярных центров в несколько, соответственно числу ядрышковых организаторов р. РНК. • Восстановление, ультраструктурной организации ядрышек после митоза сходно также с реактивацией интерфазных ядрышек: около фибриллярных центров (зоны ядрышковых организаторов хромосом) образуется сначала плотный фибриллярный компонент, а затем гранулы; ядрышко начинает расти и приобретать дефинитивную структуру, характерную для высокого уровня синтеза р. РНК. • Исследование влияния ингибиторов синтеза р. РНК на новообразования ядрышка после митоза показало, что этот процесс идет по крайней мере в два этапа. При полном подавлении синтеза р. РНК с помощью соответствующих доз актиномицина Д (1∙ 10 8 M) митоз не нарушается, но в образующихся ядрах вместо дефинитивных ядрышек наблюдаются множественные предъядрышки. Они имеют плотную фибриллярную ультраструктуру и полностью сходны с нормальными предъядрышками, возникающими в начале G 1 периода. Отличие лишь в их будущих изменениях: в отсутствие синтеза р. РНК их развитие останавливается на этой стадии. • Таким образом, на первом этапе новообразования ядрышка синтез р. РНК может отсутствовать. В этом случае при деконденсации хромосом в ядрах выявляются плотные тельца – предъядрышки, соответствующие по своим свойствам ядрышковым организаторам или сборным фибриллярным центрам. Вероятно, что в их состав входят не только участки р. ДНК, но и ряд ядрышковых белков, перенесенных в составе как ядрышковых организаторов (РНК полимераза I), так и митотических хромосом (белок В 23). На втором этапе включается синтез р. РНК, появляются сначала плотный фибриллярный, а затем и гранулярный компоненты, объем ядрышек начинает увеличиваться, и они объединяются друг с другом. Лекция 13(51) 47

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Транскрипция на мейотических хромосомах • Мейотические хромосомы типа «ламповых щеток» встречаются главным образом на стадии диплотены мейоза как у сам цов, так и у самок. По сравнению с митотическими хромосомами мейотические хромосомы типа ламповых щеток намного длиннее и хорошо видны в световом микроскопе по двум причинам: они представляют собой спаренные и удвоенные хроматиды, так что в их состав входят четыре продольные субъединицы. • Отличительной особенностью этих хромосом является наличие боковых петель, отходящих от множества хромомеров, попарно симметрично располагающихся вдоль каждого гомолога (рис. ). Именно в петлях хромосом типа ламповых щеток происходит синтез РНК во время длительной мейотической профазы. Рис. Схема диплотенных хромосом, стадия «ламповых щеток» . А – бивалент с двумя хиазмами, парное расположение боковых петель; б – пара петель на сестринских хроматидах; матрикс петли образован РНК фибриллами, продуктами генной активности этих учатков хромосом; показаны два цистрона на каждой петле, отходящей от хромоцентра Лекция 13(51) 48

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Следовательно, хромосомы типа ламповых щеток занимают как бы промежуточное положение между инактивированными максимально конденсированными митотическими хромосомами и активными интерфазными хромосомами: конденсированные участки хромомеров соответствуют участкам митотических хромосом, а боковые петли – участкам активных интерфазных хромосомных районов. Считается, что число боковых петель соответствует числу хромомеров, за исключением того, что хромомеры, представляющие центромерные участки, петель не несут. • Например, у гребенчатого тритона, чьи хромосомы ламповых щеток особенно подробно изучены, насчитывается около 5000 хромомеров на гаплоидный набор и соответственно 20 тыс. боковых петель на диплотенную хромосому (напомним, что в профазе мейоза клетки содержат тетраплоидное количество хроматид). • Латеральные, или боковые, петли в составе хромосом типа ламповых щеток неоднородны по своей структуре. Преобладают ординарные или нормальные петли длиной около 10 мкм. Они асимметричны по своей толщине: в световом микроскопе видно, что один из концов петли тонкий, а другой толстый; развернутая петля имеет клиновидную форму. В составе ординарных петель в световом микроскопе видно, что каждая петля покрыта как бы чехлом или матриксом, имеющим неясную гранулярно фибриллярную структуру. • ДНК входит в состав осевого элемента петель и представляет собой основную хромосомную ДНК. Это доказывалось тем, что как боковые петли, так и осевые компоненты диплотенных хромосом рвутся при обработке ДНКазой. Боковые петли способны к синтезу РНК: включение 3 Н уридина происходит практически во всех петлях по всей их длине. Новосинтезированная РНК в петлях быстро ассоциирует с белками, заранее синтезированными в цитоплазме. • При изучении ординарных петель на ультратонких срезах в их составе было найдено большое количество гранул величиной 25 – 40 нм, сходных с интер и перихроматиновыми гранулами интерфазного ядра и с гранулами в пуфах политенных хромосом. Лекция 13(51) 49

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток • Более подробно структура боковых петель была изучена методом электронной микроскопии на препаратах распластанных диплотенных хромосом. При этом действие низких ионных сил приводит к вымыванию большей части белков матрикса боковых петель, оставляя в целостности осевые ДНК, сидящие на них молекулы РНК полимеразы и транскрипты. • Оказалось, что общая морфология транскрипции на боковых петлях хромосом типа ламповых щеток удивительно напоминает таковую на рибосомных цистронах (рис. ). Большинство ординарных боковых петель представляет собой одну транскрипционную единицу, начало транскрипции которой расположено на одном конце петли, а терминальный участок – на другом. Таким образом, такая транскрипционная единица тоже имеет форму «елочки» , только изогнутой в виде петли. Рис. Схема ориентации транскрипционных единиц в петлях мейотических хромосом • Наблюдается линейный градиент транскриптов: короткие в начале и максимально длинные (до нескольких десятков мкм) на концах транскрипционных единиц. Транскрипты здесь представлены в виде рибонуклеопротеидов. В результате воздействия низких ионных сил они из глобул величиной 25 – 40 нм превращаются в вытянутые, изогнутые фибриллы, часто на конце имеющие утолщение. Морфология транскриптов на разных петлях неодинаковая. Встречаются расправленные, линейные фибриллы, а также кустистые фибриллы, многократно сложенные сами на себя, вероятно, в результате образования дуплексных структур РНК. • В некоторых петлях может располагаться несколько транскрипционных единиц разной длины, как с идентичной, так и с оппозитной ориентацией транскрипции (рис. ). Интенсивность транскрипции также неодинакова на различных петлях: встречаются петли с 30 и с 3 – 5 транскриптами на 1 мкм. • При падении транскрипционной активности в естественных условиях или при экспериментальном 50 подавлении синтеза РНК длина петель уменьшается, они приобретают нуклеосомное строение. Лекция 13(51)

Тема 13. 1. Клеточный цикл. Хромосомный цикл. Деление клеток Дополнительная литература 1. Свенсон К. , , Уэбстер П. . Клетка, М. , Мир, 1980 2. Ченцов Ю. С. , Общая цитология, Изд. МГУ, 1978 3. Де. Робертис Е. , Новинский В. , Саэс Ф. , Общая цитология, ИИЛ, М. , 1962 4. Хэм А. , Кормак Д. , Гистология, т. 1, М. , Мир, 1982 5. Рис Э. , Стернберг М. От клеток к атомам (Иллюстрированное введение в молекулярную биологию), М. , Мир, 1988 6. Методы генетики соматических клеток, Ред. Дж. Шей, М. Мир, т. 2, гл. 34 (Методы окраски хромосом), стр. 572 593 51