Тақырып Өсімдік клеткаларын in vitro жағдайында өсіру

Тақырып Өсімдік клеткаларын in vitro жағдайында өсіру әдістері

Жоспар: 1. Залалсыздандыру 2. Қоректік орталар 3. Клеткаларды өсіруге қажетті жағдайлар 4. Каллусты алу және оны өсіру 5. Клеткаларды сұйық қоректік орталарда өсіру

1. Экспланттарды залалсыздандыруға арналған заттар Дезинфекант аталуы формуласы Этил спирті C 2 H 5 OH Натрий гипохлориді Na. Cl. O Кальций гипохлориді Ca(Cl. O)2 Хлорамин Б (C 6 H 5 SO 2 N(Na)Cl x 3 H 2 O) Сулема Hg. Cl 2 Сутегінің асқын тотығы H 2 O 2 Бром Br Фенол C 6 H 5 OH Конц. күкірт қышқылы H 2 SO 4

Өсімдік мүшелерін залалсыздандырудың негізгі әдістері Әдістеме Мүшелер, ұлпалар Алдынала залалсыздандыру Залалсыздандыру Соңғы залалсыздандыру Тұқымдар Абсолютті этанолмен 10 сек немесе 1 -1, 5 % Na. OCl 15 мин өңдеп, ДН 2 О –мен шайқау 1 -1, 4 % Na. OCl ДН 2 О –мен 20 мин өңдеу ( немесе 10% 3 -рет кальций гипохлориді, 1% шайқау бромдалған су). Детергент ретінде 0, 05% типол қосу Сабақ немесе тамыр кесінділері Ағынды сумен жуу, 10 сек абсолютті спиртпен өңдеу 1 -1, 4 % Na. OCl 20 мин өңдеу, Детергент ретінде 1 -2 тамшы Tween-20 -60 ДН 2 О –мен 3 -рет шайқау Тамыр жемістер Ағынды сумен жуып тазалау 1 -1, 4 % Na. OCl 30 мин өңдеу ДН 2 О –мен 3 -рет шайқау

Өсімдік мүшелерін залалсыздандыру тәртібі (стевия) Ағынды және сабынды сумен 20 минут жуу 0, 023 % анолит ерітіндісімен 15 минут залалсыздандыру KMn. O 4 әлсіз ерітіндісімен 30 минут өңдеу ДН 2 О –мен 3 рет (5 минттан) шаю 0, 1 % сулемамен залалсыздандыру Ø Жапырақтарды – 8 минут; Ø Сабақ және бүршіктерді -15 минут; Ø Гүл бүршіктерді -12 минут ДН 2 О –мен 3 рет ( 5 минттан) шаю

2. Қоректік орталар құрамы Ø Негізгі бейорганикалық заттар (макроэлементтер); Микроэлементтер; Ø Темір көздері; Ø Органикалық қоспалар (витаминдер); Ø Көмірсу көздері; Ø Органикалық қосындылар (өсімдіктердің өсу регуляторлары)

Мурасиге-Скуг қоректік ортасы Компаненттер Концентр. , мг/л. Конц. , мг/л. Na 2 Mo. O 4× 2 H 2 O Макроэлементтер Компаненттер 0, 25 0, 025 KNO 3 1900 Co. Cl 2 × 6 H 2 O NH 4 NO 3 160 Темір хелаты Mg. SO 4 × 7 H 2 O 370 Fe. SO 4 × 7 H 2 O 27, 8 Ca. Cl 2 × 2 H 2 O 440 Na 2 ЭДТА 37, 3 KH 2 PO 4 170 Органикалық заттар Мезо-инозит Микроэлементтер 100 Mn. SO 4 × 4 H 2 O 22, 3 Тиамин – HCl 0, 1 KJ 0, 83 Никотин қышқылы 0, 5 H 2 BO 3 6, 2 Пиридоксин - HCl 0, 5 Zn. SO 4 × 7 H 2 O 8, 6 Сахароза 30000 Cu. SO 4 × 5 H 2 O 0, 025 p. H 5, 6 -5, 8

ü Негізгі минералды тұздар Азот, фосор, күкірт, темір; кальций, калий, магний иондары; Бор, марганец, мырыш, мыс, молибден, кобальт т. б. ЭДТА (этилдиаминтетрасірке қышқылы) немесе Na 2 ЭДТА –қоректік ортадағы темірдің сіңімділігін жақсартады.

v In vitro жағдайында клеткалар гетеротрофты қоректенетіндіктен оларға көмірсулар қажет (2 -3 % сахароза, глюкоза); v Витаминдер клеткалардағы биохимиялық процестерді ырықтандырып олардың тежелмеуіне және клеткалардың өсуіне әсер етеді. В тобы (В 1 - тиамин, В 2 -рибофлавин, В 6 –пиридоксин, Са- пантотенат – В 5 ); никотин – РР және аскорбин- С қышқылдары; мезоинозит.

v Фитогормондар – клеткадағы барлық физиологиялық процестерді реттейді - ауксиндер – ИСҚ, 2, 4 -Д, НСҚ; - цитокининдер (БАП, кинетин, зеатин); - гиббериллиндер. v Комплексті органикалық қосылыстар - экстракттар (ашытқыдан, картоптан, ісік - ұлпаларынан т. б. ); - шырындар (қайың, томат, апельсин); - пісіп жетілмеген эндоспермдер (кокос жаңғағы, каштан, жүгері); - казеин гидролизаты, амин қышқылдарының қоспалары.

v Қоректік ортаның р. Н 5, 5 -6 (табиғи жағдайда р. Н 5, 5 -7, 5) - макромолекулалардың (ферменттердің) құрылымы мен ырықтығын әсер етеді; - витаминдердің түрақтылығына және сіңімділігіне әсер етеді; - р. Н төмен ортада агар қатпайды; - Казеин гидролизаты мен ашытқы экстракты бар қоректік ортаның р. Н клеткалар өсе келе аз өзгереді.

• Агар-агар – теңіз балдырларынан өндірілетін полисахарид. - Бактериялық агар: Difco, Bacto-Agar - қоректік ортаға 7 -9 г/л қосады, - Агар сумен қосылып - гель түзеді, - 70 -800 C балқиды, - 45 -500 С қатады.

Мурасиге. Скуг Уайт Линсмайер. Скуг Гамборг және Эвелег В 5 Нич және Нич Шенк. Хильдебранк

3. Клеткаларды өсіруге қажетті жағдайлар Ø Температура - каллустық ұлпаларды өсіру - 25± 2 0 С; - клетка мен ұлпа культураларын өсіру және морфогенезді индукциялау- 18 -20 0 С; Ø Жарық (люминисцентті лампалар -1000 люкс); - морфогенезді индукциялайды; - екінші реттік метаболиттердің синтезіне әсер етеді; - жылу көзі;

ØАэрация –суспензиялық культураларды өсіруде маңызы зор; ØЫлғалдылық - 60 -70 %; ØҚоректік ортаның осмостық қысымы (полиэтиленгликоль, сорбит қосу ) – протопласттарды бөліп алғанда және оларды өсіргенде маңызды роль атқарады. Ø Ортаның жоғары осмостық қысымы клеткалардың қоректік заттарды сіңіруін қиындатады.

4. Каллусты алу және оны өсіру Клеткалардың ретсіз бөлінуі нәтижесінде пайда болған ұлпаны каллус деп атайды. Клеткалардың бөлінуі арқылы көбейіп өсуін пролиферация деп атайды.

• In vitroжағдайында түзілген каллустар

• Дифференциация – даму прцесінде біртекті клеткалардан морфологиялық белгілері және атқаратын қызметі әр түрлі клеткалардың түзілуі (клеткалардың мамандануы); • Дедифференциация – маманданған, бөліну қабілетінен айырылған клеткалардың жаңадан проллифферацияға (бөлінуге) көшуі;

Каллус ұлпасына сипаттама ü түсі; ü тығыздығы; ü ылғалдылығы; ü борпылдақтығы; ü жылтырлығы; ü түйіршіктілігі; ü каллус бетінде басқа да ұлпалардың (ақ, сұр, жылтыр қырау тәрізді үлпек, түк) болуы.

• Каллустың түзілуі: Экспланттың қоректік ортаға жанасқан бетінде; Жарақаттанған жерінде; Сабақ кесіндісінің базалды немесе апикальді бөлігінде пайда болады; Сабақтың өне бойында пайда болады. • • Каллусстардың түрлері: Морфогенді; Морфогенді емес, Эмбриогенді; Гистогенді • • •

Морфогенді каллус

Эмбриогенді каллус Суспензия культурасы

Каллус ұлпасының түзілуі мен пайда болған каллустың табиғаты: ü экспланттың тегінен, ü экспланттың жас ерекшелігінен, ü қоректік ортаның құрамынан, ü фитогормондардың табиғаты мен концентрациясынан, ü өсіру жағдайынан тәуелді.

Каллусты «бағушы-ұлпа» ретінде қолдану нұсқасы

РАХМЕТ!!!