СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ • Свободные радикалы, образование, виды. • Регуляция свободнорадикального окисления. Антиоксиданты. • Значение свободных радикалов в жизнедеятельности и развитии типовых патологических состояний. • Способы профилактики и коррекции свободнорадикального окисления. • Методы исследования свободных радикалов. • Хемилюминесценция биологических систем. • Хемилюминесцентный анализ в биологии и медицине.
Что такое свободный радикал? Свободный радикал - это молекула или её часть, у которой на внешней энергетической орбите атома или молекулы имеется электрон с неспаренным спином.
Отличительные особенности свободных радикалов: • наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне; • собственный магнитный момент; • высокая химическая активность и малое время жизни; • способность инициировать цепные реакции окисления; В понятие свободного радикала не включаются соединения, например, ионы металлов переменной валентности, неспаренные электроны которых находятся на внутренних оболочках. Радикал может образоваться из молекулы при ее окислении, например, при отрыве атома водорода (т. е. электрона и протона). Существуют монорадикалы, например, ОН* , бирадикалы- О*—О*, которые имеют два неспаренных электрона. Радикалы могут быть нейтральными и нести заряд- положительный (катион-радикал) или отрицательный (анион-радикал). Быть ионом и радикалом- это два свойства молекул, которые могут присутствовать или отсутствовать независимо друг от друга. Молекула может быть ионом, но не иметь неспаренных электронов, т. е. не быть радикалом.
Наиболее распространенные в организме формы свободных радикалов 1. Активные формы кислорода: О*2 - супероксидный анион радикал; 'O 2 - синглетная форма кислорода; OH* - гидроксильной радикал; Н 2 О 2 - перекись водорода; 2. Окисленные галогены: CLO*- гипохлорит, хлорамины; 3. Окислы азота: NO*- оксид азота, ONОO*-пероксинитрит; 4. Свободные радикалы, образующиеся при перекисном окислении липидов: RO*, RO 2*- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и другие перекисные радикалы жирных кислот; 5. Радикалы, образующиеся при обмене веществ и энергии: радикалы семихинонов, флавопротеидов, иминоксильные и другие формы радикалов
Образование свободных радикалов в организме Известно множество ферментативных и неферментативных окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых образуются различные виды свободных радикалов. Наиболее часто встречаются следующие: • последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности; • микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз; • ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ; • реакции авто окисления (глутатион, оксигемоглобин, тиолы, катехоламины, цитохромы и т. д. ); • реакции биосинтеза (простагландины, лейкотриены из арахидоновой кислоты и др. ) • окисление чужеродных соединений – ксенобиотиков, некоторых лекарственных препаратов; • действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления); • фотохимические процессы; • перекисное окисление липидов; В биологическом материале наиболее распространены реакции одноэлектронного восстановления кислорода (активные формы кислорода- АФК) и одноэлектронного окисления органических молекул, в первую очередь, ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов (перекисное окисление липидов ПОЛ).
Вторичные Радиация Радикалы токсических веществ Природные Радикалы молекулхромофоров Третичные Радикалы воды и биомолекул Радикалы антиоксидантов Первичные Радикалы липидов Гидроксил Нитроксид Супероксид Семихиноны Радикалы в организме человека Ю. А. Владимиров Чужеродные Ксенобиотики Ультрафиолет, лазерное облучение
Образование активных форм кислорода Последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности имеет место в митохондриях и микросомах клеток растительного и животного происхождения, в фагоцитах. Суть его заключается в присоединении к кислороду последовательно от одного до четырех электронов в окислительных реакциях, катализируемых ферментами класса оксигеназ. При этом образуются радикалы, получившие обобщенное название – «активные формы кислорода» : супероксидный анион радикал (О*2), синглетная форма кислорода ('O 2), гидроксильный радикал (OH*), перекись водорода (Н 2 О 2). Время полужизни OH* составляет 10 -9 сек, 'O 2 – 10 -6 сек, О*2 – 10 -5 сек, NO* - менее 1 сек, Н 2 О 2 –минуты. Активные формы кислорода обычно появляются первыми в цепи реакций свободнорадикального окисления и дают начало серии других радикалов – окисленных галогенов, окислов азота, перекисных радикалов жирных кислот.
Образование радикалов кислорода О 2 + е*→ О*2 В присутствии солей железа О 2 + 2 е*→ Н 2 О 2 +Fe 2+ → OH*+ OH-+Fe 3+ О 2 + 3 е*→ Н 2 О + ОН* Н 2 О 2 + Fe 3+→ HO 2*+H++Fe 2+ О 2 + 4 е*→ 2 Н 2 О О 2 + Fe 2+ → Fe 3++ О*2→ *О 2 +Н 2 О 2 + Fe 2+ → Fe 3++ Н 2 О 2 + О*2→ О*2 +ОН* ОН* + Fe 2+→ Fe 3++ OHО*2 +NO*→ ONОO* ГДЕ: Н О - перекись водорода; 2 2 миелопероксидаза Н 2 О 2 + CL→ CLO*+ H 2 O ОН*- гидроксильный радикал; *О 2 - синглетная форма кислорода; ONОO*- пероксинитрит; CLO*- гипохлорит; OH– ион гидроксила
Упрощение схемы химических реакций Для упрощения системы химических реакций используют два правила химической кинетики: Правило 1: Скорость нескольких последовательных реакций равна скорости самой медленной из них Правило 2: Скорость нескольких параллельных реакций в наибольшей мере определяется скоростью самой быстрой из них. Иногда можно пренебречь остальными реакциями при расчетах.
Рассматриваются 3 возможных механизма образования липидных радикалов. Первый- неферментативное окисление ненасыщенных жирных кислот, запускаемое экзогенными источниками свободных радикалов. Второй- квазиферментный. В начальной фазе индукции участвуют ферменты, генерирующие активные формы кислорода. Это 4 группы ферментов: • НАДФ и НАДФ-Н зависимые оксидазы, ксантиноксидазы; • ферменты, образующие перекись водорода (ксантиноксидаза, оксидазы D и L- аминокислот; • ферменты, синтезирующие хлорноватую кислоту (миелопероксидазы); • ферменты, синтезирующие оксид азота (Ca 2+ и кальмодулин зависимые NO-синтазы, Ca 2+ независимые NO–синтазы) Далее процесс образования липидных радикалов протекает неферментативно. Третий механизм – ферментативное свободнорадикальное окисление липидов с участием специализированных ферментов– липоксигеназ и циклооксигеназ, катализирующих окисление арахидоната и других полиненасыщенных жирных кислот с образованием циклических эндопероксидов и алифатических гидропероксидов.
В биологическом материале постоянно обнаруживается некоторое количество свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов. Их концентрация зависит от функциональной и метаболической активности. В частности, она повышается при действии кислорода, облучении, активации фагоцитоза и т. д. Наоборот, она снижается при подавлении обмена веществ. Под влиянием свободнорадикального окисления меняются многие физиологические и метаболические процессы, физикохимические свойства биологических мембран. Такие, например, как проницаемость, транспорт ионов, липидный состав, структура, активность мембрано-связанных ферментов и т. д. , что отражается на состоянии обмена веществ в целом. Имеются данные о значении свободнорадикального окисления в передаче информации в клетках, иммуномодулирующем эффекте. Отмечено накопление продуктов перекисного окисления липидов и снижение антиокислительной активности при старении. Изменение скорости свободнорадикального окисления рассматривается как одно из звеньев адаптации организма к действию факторов внешней среды.
Свободные радикалы- друзья или (и) враги ? Причина или следствие? обзорные статьи в базе MEDLINE по темe Radicals AND *** за 2001 -2005 гг
ЗНАЧЕНИЕ СВОБОДНО- РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В норме: необходимое звено метаболизма, обеспечивающее нормальную жизнедеятельность При патологии: универсальная неспецифическая основа патогенеза различных заболеваний модификация физико-химических свойств биологических мембран; защитные функции, окисление чужеродных соединений, микробицидное действие; обмен веществ, аккумуляция и биотрансформация энергии; формирование воспалительного и иммунного ответа организма; участие в образовании биологически активных веществ- хемоатрактантов, простагландинов, простациклинов, тромбоксанов, лейкотриенов, цитокинов и т. д. ; влияние на передачу информации экспрессию генов и деление клеток; регуляторные функции, способствуют накоплению в клетках вторичных мессенджеров; нарушение проницаемости, структуры, функции биомембран; повреждение белков, ферментов, липидов, нуклеиновых кислот, коллагеновых структур, деполимеризация гликозаминогликанов, кислых полисахаридов и т. д. ; ингибирование пролиферации и созревания клеток; нарушение биоэнергетики, регуляторных и защитных функций; общетоксическое, мутагенное и канцерогенное действие; повреждение клеток эндотелия, нарушение регуляции кровяного давления; индукция апоптоза; развитие аутоиммунных процессов; Свободнорадикальное окисление рассматривается как жизненно важное и необходимое звено метаболизма, нарушение которого является универсальным молекулярным механизмом, причиной и общей закономерностью развития различных по этиологии заболеваний.
При многих заболеваниях, при действии негативных факторов среды и т. д. создаются благоприятные условия для нарушения стационарного состояния свободнорадикального окисления. Оно может быть связано с комплексом причин: • избыточное появление инициаторов свободнорадикального окисления; • снижение эффективности механизмов регуляции свободнорадикального окисления; • количественные и качественные изменения субстрата окисления, его доступности и способности подвергаться окислению.
Свободнорадикальное окисление и процесс старения Существует множество теорий, объясняющих физиологический процесс старения организма. Наиболее распространены следующие из них: • теории, рассматривающие старение, как результат накопления продуктов метаболизма; • теории, представляющие процесс старения, как возникновение стресса; • теории, описывающие старение, как последствие мутаций; • старение есть результат аутоиммунных процессов в результате накопления аутоантител; • старение есть результат полимеризации белков; • старение и гибель являются запрограммированным процессом, получившим название апоптоза; Подсчитано, что за 70 лет жизни человека организм производит около одной тонны радикалов кислорода, хотя только 2 -5% вдыхаемого с воздухом кислорода превращается в его токсические радикалы. В клетке крысы может возникать до 104 вызванных активными формами кислорода повреждений ДНК в день и при постоянных условиях до 10% молекул белка могут иметь карбонильные модификации. Показано, что видовая продолжительность жизни прямо коррелирует с активностью супероксиддисмутазы (СОД), содержанием B-каротина, a-токоферола и мочевой кислоты в сыворотке крови
Основное положение свободнорадикальной теории старения сформулировали D. Harman в 1954 г. и Н. М. Эмануэль в 1958 г. Универсальной причиной старения является свободнорадикальное окисление липидов и белков: • С возрастом в тканях человека повышается содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов (пигмент липофусцин). • Под действием свободных радикалов происходит повреждение макромолекул (биологических мембран, коллагена, хроматина, структурных белков, ферментов и т. д. ). Повреждение ДНК приводит к мутациям, нестабильности генома. Развивается ряд возрастных патологий (рак, сердечно-сосудистые заболевания, угнетение иммунной системы, возрастные заболевания глаз (катаракта) и др. ). • Показано, что в клетках пожилых людей активность антиоксидантных систем снижена почти в 2 раза по сравнению с молодым организмом. • Свободные радикалы с возрастом снижают скорость клеточного деления. • Свободные радикалы стимулируют апоптоз – программируемую гибель клеток, путем раскрытия каналов клеточной стенки, находящегося в межклеточном пространстве и запускающего этот процесс. Весь комплекс воздействия свободных радикалов на организм часто называют оксидативным стрессом, а старение- хроническим оксидативным стрессом. Исходя из представлений об участии свободных радикалов в процессе старения, большое значение придается антиоксидантам. 1) почему, если теория верна, антиоксиданты малоффективны? 2) как можно защитить клетку и организм от оксидативного стресса (работы Скулачева)? 3) как активизировать внутренние резервы? 4) как определить тот лимит, после которого возникают спутники старения?
Искусственное замедление перекисного окисления липидов с помощью ингибиторов свободных радикалов позволяет значительно уменьшись повреждающее действие гипоксии на различные органы и ткани, что указывает на патогенетическое значение данного процесса при кислородном голодании. Механизм лечебного и профилактического действия антиоксидантов при инфаркте миокарда многие связывают со следующими причинами: I. Снижается потребность сердечной мышцы в кислороде и повышается эффективность окислительного фосфорилирования. В результате снижается степень кислородной недостаточности миокарда. 2. Антиоксиданты снимают стресс-реакцию. Уменьшается выброс катехоламинов, которые способны активировать свободно-радикальные процессы. 3. В период реперфузии и реоксигенации антиоксиданты предупреждают вторичную активацию перекисного окисления липидов в миокарде. . Очень важным, с точки зрения клиницистов, является восстановительный период гипоксических состояний. После длительной ишемизации тканей восстановление кровотока приводит к набуханию митохондрий и дальнейшему разобщению окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания. В этих случаях даже физиологическое содержание кислорода в крови стимулирует перекисное окисление липидов. Доказано, что после перенесенной аноксии ткани теряют способность к утилизации кислорода. В результате падения конкуренции за кислород на фоне низкой антиокислительной активности физиологические концентрации кислорода становятся избыточными. Восстановление кровотока создает условия для дальнейшей активации перекисного окисления липидов и считается одной из причин постишемических расстройств.
Многие противовоспалительные препараты обладают антиоксидантными свойствами, а ингибиторы свободнорадикальных реакций оказывают выраженное противовоспалительное действие. В тоже время, применение антиоксидантов в клинической практике требует дифференцированного подхода. Нельзя забывать, что вырабатываемые фагоцитами активные формы кислорода обладают защитным микробицидным действием. Подавление их образования антиоксидантами может повлечь за собой генерализацию микробной инвазии. Не исключено также, что имеются отличительные особенности изменения свободнорадикального окисления в зависимости от характера, стадии и формы воспалительного процесса, которые следует учитывать. В этой связи встает вопрос о необходимости оценивать состояние и управлять свободно-радикальным окислением при лечении и профилактике воспалительных заболеваний.
1. Известно, что при атеросклерозе меняется не только концентрация, но и многие физикохимические свойства липопротеинов, осуществляющих обмен холестерина, фосфолипидов между сосудистой стенкой и кровью. 2. В норме липопротеины низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП), относящиеся к атерогенному классу, осуществляют доставку липидов к интиме сосудов, а липопротеины высокой плотности (ЛПВН) их удаляют. ЛПОНП и ЛПНП подвергаются перекисному окислению в присутствии ионов железа, геминовых соединений, при недостаточности витамина Е. 3. Окисленные липопротеины быстрее поглощаются эндотелиальными клетками, ускоряется освобождение холестерина и его захват гладкомышечными и эндотелиальными клетками, фибробластами. 4. Окисленные ЛПНП и ЛПОНП являются хемоаттрактантами для моноцитов, вызывают их адгезию к эндотелию. Они же поглощаются макрофагами, способствуя превращению резидентных форм макрофагов в пенистые клетки, что характерно для ранних стадий склероза 5. При окислении липопротеинов высокой плотности ЛПВП, оболочка молекулы становится более плотной. На ней накапливается свободный холестерин и ЛПВП частично теряют способность забирать холестерин с мембран гладкомышечных клеток артерий. 6. Ускорение перекисного окисления и отложение перекисных продуктов в интиме вызывает набухание и нарушение проницаемости, а также повреждение клеточных мембран, ведет к потере гликокалинса, что влияет на скорость переноса липидов между кровью и сосудистой стенкой.
Подтверждением роли свободно-радикального окисления в патогенезе атеросклероза могут служить сведения об эффективности лечебного и профилактического действия природных антиоксидантов. Аскорбиновая кислота, рутин, восстановленный глутатион, витамин Е и др. задерживают развитие атеросклеротического поражения сосудов. Наоборот, снижение содержания антиоксидантов в диете экспериментальных животных или введение в рацион перекисей липидов ускоряет возникновение типичных склеротичесих повреждений. Совокупность изменений концентрации, химико-физических свойств липопротеинов, структуры интимы способствует повышенному переходу липидов с ЛПОНП и ЛПНП в стенки сосудов и уменьшению акцепторных свойств ЛПВП. Не случайно из всех липопротеинов наиболее легко окисляются именно атерогенные ЛПОНП и ЛПНП.
Подводя краткий итог можно сделать следующее обобщение. Во-первых, необходимо подчеркнуть, что в процессе жизнедеятельности в органах, тканях, клетках, субклеточных структурах постоянно образуются свободные радикалы, имеются различные перекисные продукты. Во-вторых, изменению состояния свободнорадикального окисления в последнее время начинают отводить большую роль, считая её основой молекулярного механизма повреждения биологических мембран при многих заболеваниях. При этом внешнее патологическое воздействие либо непосредственно ускоряет свободнорадикальные реакции, либо создает для этого необходимые условия, например, путем угнетения защитных механизмов регуляции окисления. Однако, подобное разделение условно, так как при патологии, как видно из приведенных данных, на состояние свободнорадикального окисления действует обычно комплекс различных факторов. В-третьих, на основании анализа литературных данных следует, что особого внимания требует совершенствование методов исследования процесса свободнорадикального окисления. Трудности в регистрации свободных радикалов и перекисных продуктов ведут к тому, что довольно часто еще возникает вопрос: соответствует ли их содержание в тканях, подготовленных к исследованию, тому количеству, которое имелось в них до проведения измерений. Для исследования свободно-радикальных процессов требуются такие методы, которые вносят минимальные изменения в биологические объекты и позволяют в ранних стадиях заболевания обнаружить нарушение перекисного окисления липидов.
1. 2. 3. 4. 5. Вопросы для самоподготовки Свободные радикалы. Отличительные особенности свободных радикалов. Наиболее распространенные в организме формы. Образование свободных радикалов в организме. Природные и чужеродные радикалы. Первичные и вторичные. Активные формы кислорода. Виды. Образование. Значение в жизнедеятельности и при патологии. Липидные радикалы. Образование. Значение в жизнедеятельности и при патологии. Значение свободнорадикального окисления в норме и при патологии.
Рекомендуемая литература Владимиров Ю. А. , Проскурина Е. В. Лекции по медицинской биофизике. Акакдемкнига, 2007, 432 с. Журавлев А. И. , Белановский А. С. , Новиков В. Э Основы физики и биофизики Мир, 2008, 384 с. Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Учебник. – М. : Физматлит, 2004. – 448 с. Кудряшов Ю. Б. , Перов Ю. Ф. , Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения / Учебник. – М. : Физматлит, 2008. – 184 с. Рубин А. Б. Биофизика. Учебник. В 2 -х томах Издательство Юрайт, Книжный дом Университет, 2004.
Регуляция процессов свободнорадикального окисления Оксидативный стресс - процесс, повреждения биологческих структур, протекающий с участием свободных радикалов. Антиоксиданты - соединения, тормозящие процессы оксидативного стресса. Регуляция свободнорадикального окисления в организме имеет свои особенности.
В последних обзорах, посвященных свободнорадикальному окислению и системам, которые регулируют интенсивность этого процесса в организме, предлагается выделять следующие факторы: 1) системы, которые поддерживают строго определенную структуру биомембран, в частности, плотность упаковки ненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах. Они регулируют скорость реакции инициирования и продолжения цепи окисления; 2) системы, регулирующие обмен фосфолипидов мембран и состав ненасыщенных жирных кислот. Влияют на скорость инициирования и продолжения цепей окисления; 3) системы ферментов, ответственные за образование и гибель активных форм кислорода и свободных радикалов, или участвующие в разложении гидроперекисей. Действуют на всех трех стадиях окисления липидов; 4) соединения, которые играют роль катализаторов или ингибиторов окисления (например, металлы переменной валентности, глутатион, аскорбиновая кислота и т. д. ). Они оказывают влияние на процессы инициирования, продолжения и обрыва цепей перекисного окисления липидов. 5) системы, утилизирующие продукты окисления и не дающие возможности их участия в дальнейших реакциях (продолжение и разветвление цепей окисления. Еще нет строгой классификации и единых взглядов на механизмы регуляции свободнорадикальных реакций в организме и действия защитных сил. Более того, отмечается, что в процессе окисления значение и вклад различных механизмов в регуляции свободнорадикального окисления существенно меняется.
РЕГУЛЯЦИЯ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ Специфические механизмы, непосредственно влияющие на скорость окисления in vitro и in vivo Неспецифические факторы, создающие условия для изменения скорости окисления in vivo факторы, влияющие на инициаторы окисления, в частности, на состояние металлов переменной валентности; перехватчики активных форм кислорода (метионин, гистамин и т. д. ) ферменты, ответственные за образование и метаболизм активных форм кислорода (супероксиддисмутаза, каталаза и др. ); системы, утилизирующие перекисные продукты (глутатион-пероксидаза, глутатион -редуктаза и др. ); биоантиоксиданты, действующие на различных стадиях окисления (токоферол, церулоплазмин, убихинон и др. ); механизмы, регулирующие количество и качество субстрата окисления и его доступность; физико-химические свойства биологических мембран; механизмы, поддерживающие низкое содержание кислорода (р. О 2) в тканях; вещества, вызывающие появление в организме других биологически активных продуктов, участвующих в свободно-радикальном окислении или регуляции этого процесса Скорость окисления поддерживается на постоянном уровне сложной, многоступенчатой системой регуляции
АО прямого действия, обладают непосредственными антирадикальными свойствами, которые можно обнаружить в тестах in vitro. Большую часть широко используемых лекарственных препаратов антиоксидантного действия составляют АО прямого действия. Особенности антиоксидантного действия веществ определяются в первую очередь их химической природой. АО косвенного действия способны снижать интенсивность СРО только в биологических объектах (от клеточных органелл до целого организма), но неэффективны in vitro. Механизмы их действия могут быть различны: активация (реактивация) антиоксидантных ферментов; подавление в организме реакций, приводящих к образованию АФК; сдвиг реакций СРО в сторону образования менее реакционноспособных соединений; селективная индукция генов, кодирующих белки систем антиоксидантной защиты и репарации повреждений; нормализация обмена веществ и т. д. Более того, препараты, обладающие фармакологической активностью, иной, чем антиоксидантная, также могут снижать интенсивность процессов СРО и степень окислительного повреждения in vivo. При патологии интенсивность СРО повышена в той или иной степени практически во всех случаях. Естественно, что нормализация тех или иных обменных процессов в организме должна по логике вещей приводить к снижению продукции АФК и уровня СРО. Таким образом, любое вещество, нормализующее метаболические процессы в организме, способно на уровне организма проявить «антиоксидантный» эффект.
Вопросы для самоподготовки 1. Регуляция сободнорадикального окисления в биологическом материале. 2. Супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидазы. Механизмы антиоксидантного действия. 3. Хелаторы ионов металлов. Механизм антиоксидантного действия. 4. Перехватчики радикалов. Принцип действия перехватчиков. 5. Антиоксидантные функции витаминов С и Е.
Рекомендуемая литература • Владимиров Ю. А. , Проскурина Е. В. Лекции по медицинской биофизике. Акакдемкнига, 2007, 432 с. • Журавлев А. И. , Белановский А. С. , Новиков В. Э Основы физики и биофизики Мир, 2008, 384 с. • Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Учебник. – М. : Физматлит, 2004. – 448 с. • Кудряшов Ю. Б. , Перов Ю. Ф. , Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения / Учебник. – М. : Физматлит, 2008. – 184 с. • Рубин А. Б. Биофизика. Учебник. В 2 -х томах Издательство Юрайт, Книжный дом Университет, 2004.
Методы исследования процессов свободнорадикального окисления Нестабильность свободных радикалов, быстрый распад и включение в метаболизм продуктов свободно-радикального окисления затрудняют их обнаружение в биологическом материале. Поэтому довольно часто возникает вопрос о соответствии содержания свободных радикалов в пробе, подготовленной к исследованию, тому количеству, которое имелось в естественных условиях. Методы исследования свободнорадикального окисления должны отвечать следующим требованиям: • обладать высокой чувствительностью и надежностью; • быть удобными в эксплуатации, простыми и доступными, экономичными; • должны отсутствовать длительные и трудоемкие процедуры приготовления объекта к анализу, которые могут вносить изменения в исследуемый материал.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ Электронный Определение продуктов Хемилюминесценцияпарамагнитный окисления собственная и резонанс- ЭПР (биохимические маркеры, активированная (возникает (прямое диеновая коньюгация, при взаимодействии обнаружение триены и т. д. , ингибиторный радикалов) радикалов и анализ) метод спиновых ловушек) Измерение уровня антиоксидантов определяются в изменяются в пробе после обнаруживаются основном истощения защитных нестабильные, коротко стабильные механизмов; живущие радикалы; исследование экономично не нуждается в особых лабораторных условиях и специальной подготовке необходима специальная подготовка материала, во время которой исследуемого материала, во время которой возможно появление артефактов; требуются особые лабораторные условия для отвечает требованиям проведения анализа; экспресс-анализа; трудоемкость, большие затраты времени и прибор портативен, легко средств на исследование; транспортируется;
Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) • Прямое измерение сигнала радикалов Ш Сигналы стабильных радикалов Ш Метод быстрого смешивания Ш Стабилизация радикалов при низких температурах • Метод спиновых ловушек
Биохимические методы изучения свободных радикалов • Биомаркеры • Диеновая коньюгация • Ингибиторный анализ
Маркеры липидной пероксидации Цепное окисление Липогидропероксид Липоксигеназа R R Алканы Коньюгированные диены O Альдегиды a-, b -ненасыщенные альдегиды Малоновый диальдегид R O Алифатические альдегиды OH O R транс-4 -гидроксиалкеналь
Спектры диеновых коньюгатов Оптическая плотность 1, 0 Образование коньюгированных диенов при УФ-облучении фосфолипидов митохондрий 234 нм 0, 5 УФ-облученные Необлученные 0, 0 250 Длина волны, нм 300
Несмотря на широкий арсенал различных способов, позволяющих производить количественный и качественный анализ радикалов, большая их часть оказалась малопригодной в биологических исследованиях. • Так, например, сигналы ЭПР от тканей слабы, линии размыты, их трудно идентифицировать. Ткани перед исследованием должны быть подвергнуты замораживанию и высушиванию, что ведет к изменению естественных условий образования радикалов. При этом обнаруживаются только устойчивые радикалы, период полураспада которых не короче 10 мсек, а концентрация не ниже 10 -8 моля. Есть возможность увеличить срок жизни радикалов с использованием спиновых ловушек. • Определение активных форм кислорода в биологическом материале спектрофотометрическими способами осложняется наличием поглощающих в данной области спектра других веществ и неспецифичностью метода. • Концентрация продуктов окисления в тканях зависит от соотношения интенсивности их образования и распада. При наличии эффективных механизмов утилизации она начинает возрастать только после истощения защитных сил, когда ускорение свободнорадикального окисления становится доминирующим в клинической картине поражения. Кроме того, определение диеновых и триеновых конъюгатов, шиффовых оснований, гидроперекисей требует выделения из биологического материала липидов. Исследования должны производится в строго контролируемых, специально подобранных условиях, исключающих разрушение или образование продуктов окисления во время подготовки объекта. • Определение антиокислительной активности ткани трудоемко, требует специальных лабораторных условий, отнимает много времени. Для получения полной картины о состоянии процессов регуляции свободнорадикального окисления, необходимо одновременное комплексное изучение всех защитных механизмов, ферментативных и неферментативных, что практически невозможно.
1. 2. 3. 4. 5. Вопросы для самоподготовки Основные методы исследования свободнорадикального окисления. Метод электронного парамагнитного резонанса. Биохимические методы изучения свободных радикалов. Биомаркеры для изучения оксидативного повреждения белков и нуклеиновых кислот, обнаружения липидной пероксидации в организме пациентов. Метод диеновой коньюгации. Теоретические основы и способы определения коньюгированных диенов. Применение ингибиторов при изучении роли радикалов в различных процессах.
Рекомендуемая литература • Владимиров Ю. А. , Проскурина Е. В. Лекции по медицинской биофизике. Акакдемкнига, 2007, 432 с. • Журавлев А. И. , Белановский А. С. , Новиков В. Э Основы физики и биофизики Мир, 2008, 384 с. • Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Учебник. – М. : Физматлит, 2004. – 448 с. • Кудряшов Ю. Б. , Перов Ю. Ф. , Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения / Учебник. – М. : Физматлит, 2008. – 184 с. • Рубин А. Б. Биофизика. Учебник. В 2 -х томах Издательство Юрайт, Книжный дом Университет, 2004.
История изучения слабого свечения Год Автор Объект Метод регистрации 1924 А. Г. Гурвич Клетки растений и животных Митотический индекс или число почек 1934 Г. М. Франк, С. Родионов Химические реакции, дрожжи Счетчик фотонов 1938 Р. Одюбер (R. Aubert) Химические реакции Счетчик фотонов 1952 А. Стрелер (A. Strehler) Послесвечение листьев растений ФЭУ, охлаждаемый жидким азотом 1954 Л. Коли и сотр. (L. Colli et. al. ) Проростки растений ФЭУ, охлаждаемый твердой углекислотой 1959 Ю. А. Владимиров, Ф. Ф. Литвин Дрожжи, мышца ФЭУ, охлаждаемый жидким азотом
Биолюминесценция Aequorea victoria Tortugas Abraliopsis GFP Hydroid
ФОТОЭЛЕКТРОННЫЕ УМНОЖИТЕЛИ (ФЭУ) Вакумный прибор, в котором имеются электроды, изготовленные из сплава металлов, из которого легко выбивается электрон. Первый электрод- фотокатод, затем несколько динодов и последнийфотоанод. В основе работы ФЭУ лежит явление фотоэффекта. Между электродами прикладывается высокое напряжение. Фотон выбивает из катода электрон, который ускоряется в электрическом поле и выбивает из следующего динода новую порцию вторичных электронов. Лавина электронов нарастает от динода к диноду и на фотоаноде регистрируется электрический импульс.
Характеристики ФЭУ: 1. Квантовый выход фотокатода (отношение электронов, выбитых с фотокатода светом, к числу квантов, попавших на него); 2. Спектральная чувствительность (зависимость квантового выхода от длины волны падающего фотона); 3. Коэффициент усиления (отношение числа электронов, попавших на анод, к числу электронов, попавших на катод ≈ 106 -107); 4. Интегральная анодная чувствительность (характеризует выходной ток ФЭУ при стандартном освещении); 5. Шум ФЭУ: • термоэлектронная эмиссия (зависит от температуры); • автоэлектронная эмиссия (вырывание электронов приложенным электрическим полем); • ионная и оптическая связь (ионизация молекул остаточного газа)
УФИМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АВИАЦИОННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ХЕМИЛЮМИНОМЕР ХЛ-003 Предназначен для регистрации и анализа параметров хемилюминесценции-свечения, возникающего при химических и биохимических реакциях, биологических процессах, сопровождающихся образованием свободных радикалов.
Внешний вид прибора
ЭТАПЫ РАБОТЫ ОБЪЕКТ И ХАРАКТЕР ИССЛЕДОВАНИЯ 1. РАЗРАБОТКА ПОРТАТИВНОГО ПРИБОРА И ЭКСПРЕСС МЕТОДОВ ИЗМЕРЕНИЯ БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ • БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ; • ПРОБЫ СРЕДЫ; • МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ; 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ТИПОВЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ • ПАТОЛОГИЯ ОРГАНОВ И СИТЕМ (ВОСПАЛЕНИЕ, ГИПОКСИЯ, ГИПЕРОКСИЯ, АТЕРОСКЛЕРОЗ, ОЖОГИ, ШОК, ЗАБОЛЕВАНИЯ СЕРДЦА, ПЕЧЕНИ, ПОЧЕК, И Т. Д. ) 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ • ФИЗИЧЕСКИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ; • МЕДИКАМЕНТОЗНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ; • ДЕЙСТВИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ, • ПРОДУКТЫ ПИТАНИЯ
Хемилюминесценция при окислении люминола Люминол – реагент на OH и Cl. O¯ гидроксилрадикал O N- · люминол-анион 2 - N NH - люминол-диоксид O люминол гидропероксид O NH 2 O- O O N 2 2 O O O N NH OO - · OO- O люминол-радикал O O -O N NH O 2 N HO· NH NH супероксидрадикал OH O NH 2 O 3 -аминофталат + фотон
Механизм люцигенин-зависимой ХЛ (Люц-ХЛ) Катион-радикал люцигенина ∙Luc¯ дает свечение в результате взаимодействия с супероксидом ∙O 2¯ Luc 2+ + e¯ ∙Luc¯ O 2 + e¯ ∙O 2¯ ∙Luc¯ + ∙O 2¯ Luc-O 2 (диоксетан) Luc-O 2 2 MA (метилакридон) + hn (1) (2) (3) (4)
ЗАПИСЬ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ: слева- имитирующей генерацию АФК; справа- реакции ПОЛ. 1–контроль, 2– 4 ( добавлен антиоксидант мексидол в возрастающих концентрациях- 0, 001; 0, 1 мг/мл. По оси абсцисс t–длительность ХЛ (мин), по оси ординат I–интенсивность ХЛ (отн. ед. ).
Хемилюминесценция (отн. ед. ) Действие карнозина на кинетику 10 8 Карнозин (м. М) 6 4 4 2 2 8 2+ Fe 0 0 0 4 8 Время (мин) 12
Общая характеристика хемилюминесцентных методов исследования
К достоинствам метода исследования свободнорадикального окисления, основанного на регистрации хемилюминесценции биологического материала следует отнести: 1. высокую чувствительность (определяется 10 -10 М радикалов); 2. удается выявить наиболее реакционно-способные, короткоживущие радикалы, которые другими методами не регистрируются; 3. измерение свечения ведется в естественных условиях, нет необходимости специальной подготовки материала к исследованию, во время которого количество свободных радикалов может изменится; 4. это единственный метод исследования, не требующий особых лабораторных условий. 5. при необходимости интенсивность свечения биоматериала может быть искусственно увеличена. Получаемая в этих случаях дополнительная информация представляет ценность для изучения процессов свободнорадикального окисления и характеристики образующихся радикалов; 6. процессы измерения свечения и обработки получаемых результатов проводятся в автоматическом режиме, что позволяет исключить технические ошибки, повысить точность и объективность получаемой информации, не предъявляя высоких требований к квалификации исследователя; 7. прибор для исследования хемилюминесценции легко транспортируется; 8. метод отвечает всем требованиям, предъявляемым к экспресс способам анализа, техника регистрации свечения проста, занимает не более 10 -20 минут. Она полностью безопасна и не обременительна для пациента, не требует подготовки обследуемого.
Вопросы для самоподготовки 1. Что такое хемилюминесценция? Квантовый выход ХЛ. Квантовый выход возбуждения и квантовый выход эмиссии. 2. Происхождение биолюминесценции. Виды хемилюминесценции в живых системах. 3. Собственное свечение тканей и клеток. Митогенетические лучи. Опыты Гурвича. 4. История изучения слабого свечения тканей и клеток животных и человека 5. Основные элементы аппаратуры для измерения хемилюминесценции. 6. Химические реакции, ответственные за сверхслабое свечение животных тканей. 7. Клеточная хемилюминесценция, как проводятся измерения? 8. Активаторы хемилюминесценции, используемые при изучении клеток крови. Принцип их действия и специфичность. 9. Что дает изучение хемилюминесценции для медицины?
Рекомендуемая литература Владимиров Ю. А. , Проскурина Е. В. Лекции по медицинской биофизике. Акакдемкнига, 2007, 432 с. Журавлев А. И. , Белановский А. С. , Новиков В. Э Основы физики и биофизики Мир, 2008, 384 с. Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Учебник. – М. : Физматлит, 2004. – 448 с. Кудряшов Ю. Б. , Перов Ю. Ф. , Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения / Учебник. – М. : Физматлит, 2008. – 184 с. Рубин А. Б. Биофизика. Учебник. В 2 -х томах Издательство Юрайт, Книжный дом Университет, 2004.
Скачать презентацию СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ Свободные радикалы образование виды
салават.ppt