Світова мікроскопія Основні положення n Мікроскоп —

Світова мікроскопія

Основні положення n Мікроскоп - складний оптико-механічний прилад, який служить для розгляду об'єктів, недоступних неозброєному оку. Він дає збільшене, зворотнє й мниме зображення. Існує два основних принципів мікроскопії: світлова й електронна й відповідно два напрямки методологічних підходів. n Вони розрізняються за принципом розгляду об'єкта: в одному випадку в потоці видимої частини електромагнітного випромінювання (довжина хвилі 400 -550 нм), в іншому випадку в потоці електронів з довжиною хвилі залежно від напруженості електромагнітного поля до 2 нм. n Розв'язна здатність (межа дозволу) – це мінімальна відстань між двома n Розв'язна здатність світлового мікроскопа (d) залежить не тільки від довжини хвилі джерела висвітлення (λ), але й від коефіцієнта переломлення середовища (n), через яку відбувається спостереження об'єкта, а також від кута нахилу, під яким промені висвітлення входять в об'єктив. Вона визначається по формулі: λd = λ / n · sin α n Показники знаменника цієї формули (n · sin α) складають числову апертуру (А), що є головною характеристикою об'єктивів поряд з їх збільшенням. крапками об'єкта, при якому вони видні роздільно. Розв'язна здатність людського ока становить близько 100 мкм. Максимальна розв'язна здатність світлового мікроскопа залежно від використовуваного джерела світла - 0, 130, 20 мкм. Найбільше корисне збільшення його близько 1000 разів.

Принципова схема класифікації світлової мікроскопії

Типи мікроскопів Прямий лабораторного класу Прямий люмінісцентний дослідницького класу

Типи мікроскопів Інвертований мікроскоп дослідницького класу

Класифікація об'єктивів n При класифікації об'єктивів вони розділяються за принципом розрахункової якості зображення, параметричним і конструктивно-технологічним ознакам, а також залежно від методів дослідження й контрастування. За принципом розрахункової якості зображення об'єктиви можуть бути: ахроматичними, апохроматичними, об'єктивами плоского поля (план об'єктиви). n Ахроматичні об'єктиви розраховані для застосування в спектральному діапазоні 486 - 656 нм. Виправлення будь-якої аберації (ахроматизація) виконано для двох довжин хвиль. У цих об'єктивах усунуті сферична аберація, хроматична аберація, кома, астигматизм і частково сферохроматична аберація. n Апохроматичні об'єктиви використовуються в широкій спектральній області; ахроматизація виконується для трьох довжин хвиль. При цьому крім хроматизму, сферичної аберації, коми й астигматизму досить добре виправляються також вторинний спектр і сферохроматична аберація, завдяки введенню в оптичну систему об'єктива лінз із кристалів і спеціальних стекол. У порівнянні з ахроматами, ці об'єктиви звичайно мають підвищені числові апертури, дають чітке зображення й точно передають колір об'єкта.

Класифікація об'єктивів Сучасні об'єктиви, що мають проміжну якість зображення (напівапохромати ), звуться мікрофлюари. n У планоб’єктивах виправлена кривизна зображення по полю, що n Планоб’єктиви звичайно застосовуються при фотографуванні, причому найбільш ефективне застосування планапохроматів. n Потреба в описаних об'єктивах дуже висока, однак вони мають досить високі ціни. Тому рутинні й робочі мікроскопи комплектуються так званими економічними об'єктивами. До них належать об'єктиви з поліпшеною якістю зображення по полю: ахростигматы (фірма Leica), Ср-Ахромати й ахроплани (фірма Zeiss), стігмахромати (фірма ЛОМО). забезпечує різке зображення об'єкта по всьому полю спостереження. При виправленні аберацій об'єктиви називаються план ахроматами або планапохроматами.

Об'єктиви для світлового мікроскопу

Оптичні викривлення Коматична аберація (кома) Хроматична аберація (кома) дифракція Сферична аберація

Методи світлової мікроскопії метод світлого поля

Метод Фазового контрасту

Комплект фазово-контрастного устаткування КФ-4

Живі клітини у фазовому контрасті

Метод інетерференційного фазового контрасту Номарскього (DIC)

Метод гістохімічної люмінісцентної мікроскопії

Метод полярізованого світла ПРИНЦИП ДІЇ Використовуються властивості поляризованного світла для ідентифікації і характеризації структури та властивостів матеріалів Любі оптичні мікроскопи можуть давати зображення по методу простої поляризації, але для цього потрібно використовувати спеціальний поляризатор та аналізатор

Метод конфокальной лазерной мікроскопії

Люмінесцентна мікроскопія

Схема прямого епілюмінесцентного мікроскопа

Спектральні фільтри

Автофлуоресценція листків малини

Імуноферментні методи Антигеном називають будь-яка речовину, що при влученні в тканині сприйнятливого організму викликає імунну відповідь, у результаті якого формуються специфічні антитіла, які потім зв'язуються з даною речовиною. Антигенами звичайно є високомолекулярні білки й полысахариди, рідше ними є поліпептиди, ліпіди й нуклеінові кислоти. Та частина молекули антигену, що з'єднується з антитілом, називається епітопом або антигенною детермінантою. Біологічні об'єкти, які складаються з безлічі макромолекул, наприклад бактерії, містять велика кількість епітопів, що визначає розмаїтість антитіл, специфічних даному об'єкту. Імунну відповідь можуть викликати й низькомолекулярні речовини, або гаптени, у тому випадку, якщо вони з'єднуються з високомолекулярними «носіями» (білками, полісахаридами). У якості гаптенів можуть виступати лікарські речовини, моно- і полісахариди, низькомолекулярні поліпептиди, фосфоліпіди, тригліцериди. Антитіла, являють собою γ-глобулінову білкову фракцію плазми й називаються імуноглобулінами. Найпоширенішийо клас імуноглобулінів G (Ig). Молекула Ig складається із двох субодиниць, з'єднаних дисульфідними зв'язками. Кожна субодиниця складається із двох поліпептидних ланцюгів - важкого ( Н-ланцюга) і легкого ( L-ланцюга).

У кожній молекулі Ig виділяють наступні області: Fc-фрагмент (constant fragment) і Fab-фрагмент (antibody fragment). Структура Fc-фрагмента ідентична для всіх молекул Ig у певного виду тварин. Таким чином, Fc -фрагмент визначає видоспецифічність антитіл і не бере участь у взаємодії антитіла с антигеном. Структура Fab-Фрагмента вкрай варіабельна. Fab-фрагмент визначає специфічність антитіла, оскільки бере участь у взаємодії з епітопом антигену. Кожна молекула Ig має у своєму складі два Fab-фрагменти, тобто є бівалентною і може з'єднуватися із двома різними антигенними детермінантами. Імуноглобуліни є макромолекулами й самі можуть виступати в ролі антигенів. При введенні імуноглобулінів в організм тварини іншого виду одержують антитіла до Fc-фрагменту. Оскільки Fc-фрагмент визначає видоспецифічність, то отримані антитіла є специфічними до всіх можливих імуноглобулінів даного виду тварини. Таким способом одержують т. зв. «вторинні антитіла» або антисироватки, що використовуються при постановці імуногістохімічних реакцій.

Імуноферментні методи візуалізації n Метод прямої имунофлуоресценції — антиген звязується антитілом, конъюгіваним з флуоресцентною міткою (флуорохромом, наприклад: FITС — флюоресцеіна ізотіоционатом, TRITC — тетраметилродамін ізотіоционатом). Недоліки метода: - низька чутливість - прехресні реакції - швидке руйнування флуоресцентної мітки

Метод непрямої имунофлуоресценції антиген звязується з неконъюгованим специфічним антитілом (первинним антитілом). Флуоресцентна мітка конюгована з вторинним антитілом, специфічним до Fc-фрагменту первинного антитіла. Недоліки метода: - прехресні реакції - швидке руйнування флуоресцентної мітки

Методи FISH гібридизації in situ

Мікрофотодокументція