Световая и электронная микроскопия в гистологии Лекция 1

Световая и электронная микроскопия в гистологии Лекция 1

МИКРОСКОП (от греческого mikros - малый и skopeo - смотрю), оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и их деталей, не видимых невооруженным глазом. Евклид (300 г. до н. э) Птоломей (127 -151 гг. ) Оптические свойства линз Сальвинио дели Арлеати (Италия, 1285 г. ) Первые очки

Леонардо да Винчи (Италия, XVI в. ) Использование лупы для анализа малых объектов Потомственные оптики Захарий и Ханс Янсены (Нидерланды, 1590 г. ) Создание первого микроскопа – две выпуклые линзы внутри одной трубки, заложили основы для создания сложных микроскопов. Микроскоп Янсена, увеличение 3 -10 раз.

• Галилей (1610 г. ) сконструировал микроскоп путем сочетания линз в свинцовой трубке. • 1611 Kepler suggests a way of making a compound microscope. • Декарт в своей книге "Диоптрика" (1637 г. ) описал сложный микроскоп, составленный из двух линз - плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). • 1655 Hooke uses a compound microscope to describe small pores in sections of cork he calls “cells”.

А. van Leeuwenhoek (1632 -1723, Нидерланды) Бизнесмен, микроскопистлюбитель, достиг редкостного совершенства в тонком искусстве шлифовки линз. Сложной многолинзовой системе, включающей объектив и окуляр, исследователь предпочитал простые однолинзовые микроскопы, то есть лупы разных конструкций, дававшие увеличение до 270 раз. Впервые описал бактерий и простейших, первым увидел эритроциты и пронаблюдал их движение в кровеносных сосудах. Открыл сперматозоиды.

Микроскоп Левенгука, конструкция 1670 г.

Микроскоп Левенгука

Рисунки Левенгука А Б А- гидра и ее щупальце, Б – формы бактерий

Гюйгенс Христиан (Нидерланды, 1629 -1695) • Изобрел простую двухлинзовую систему окуляров стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопа. Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров неудобно для глаз по сравнению с современными широирокообзорными окулярами.

• 1886 Zeiss makes a series of lenses, that enable microscopists to resolve structures at theoretical limits of visible light. • Эрнст Аббе, физик, условие синусов Аббе. • Отто Шотт, химик, специалист по стеклу.

Эрнст Аббе «Условие синусов Аббе» , позволяло убрать искажения, возникающие в системах со многими линзами, — так называемую сферическую аберрацию. Этот дефект обусловлен тем, что лучи, прошедшие через линзу, не собираются в одной точке, а распределяются по оси. Для иллюстрации этого вопроса Аббе предложил тест-объект: специальный рисунок, который через качественную оптическую систему трансформируется в правильную прямоугольную решетку. Аббе протестировал десятки старых микроскопов, созданных по наитию хорошими мастерами. Оказалось, что в них тест-объект принимает ожидаемый вид.

Световая микроскопия • увеличение до 2 -3 тысяч раз • цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценки его динамики и химизма. • Основные характеристики любого микроскопа - разрешающая способность и контраст.

• Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0. 2 мм. • Resolving power is inversely proportional to the wavelength of the radiation it uses

• Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 -4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. • На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. • Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

• Вследствие дифракции света на краях оптических деталей даже в идеальной оптической системе изображение точки есть не точка, а кружок с центральным светлым пятном, окруженным кольцами (попеременно тёмными и светлыми в монохроматическом свете, радужно окрашенными — в белом свете. В оптических системах полностью устранить аберрации невозможно.

The stained portions of the cell reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them. A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. (B) Light passing through the unstained, living cell undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects

Метод светлого поля в проходящем свете • • применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей Увеличение в 2000 -3000 раз.

• Темнопо льная микроскопи я — вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата [1]. Основы метода разработаны Р. Зигмонди в 1906 году. • Темнопольная микроскопия практически лишена артефактов

• Метод тёмного поля в проходящем свете • используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.

Метод тёмного поля в проходящем свете

Метод тёмного поля в проходящем свете

Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy-Normarski optics

ДИК (дифференциально-интерференционный контраст)

Поляризационная микроскопия • Метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различных направлениях и проявляются поразному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Анализируя изменения плоскости поляризации света, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Восьмикратно увеличенный отпечаток ракушки древнего моллюска в поляризованном свете. • .

Renal epithelial cells containing fat globules; bottom right, high magnification view of same cells viewed with polarizing microscope and showing typical “maltese cross” formation displayed by fat in polarized light.

• Фазово-контрастная микроскопия — метод получения изображений в оптических микроскопах, при котором сдвиг фаз электромагнитной волны трансформируется в контраст интенсивности. Фазовоконтрастную микроскопию открыл Фриц Цернике, за что получил Нобелевскую премию за 1953 год.

Фазово-контрастная микроскопия • Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости ( «амплитудный рельеф» ), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастная микроскопия

Four images are shown of the same fibroblast cell in culture. (A) Brightfield microscopy. (B) Phase-contrast microscopy. (C) Nomarski differentialinterference-contrast microscopy. (D) Dark-field microscopy.

Флуоресцентная микроскопия

Epi-fluorescent image showing metaphase in newt lung cell. Three fluorescent probes--specific for DNA, keratin, and tubulin--were used. Blue, metaphase chromosomes (DNA); red, keratin filaments; yellow, spindle apparatus made of microtubules.

Морские гидробионты - источник флуоресцентных белков

Использование флуоресцентных белков

A light micrograph of the large polytene chromosomes from Drosophila, stained with a fluorescent DNA-binding dye. • • Все флуоресцентно-меченые структуры образца испускают свет при возбуждении светом соответствующих длин волн – независимо от того, находятся ли они в фокальной плоскости или нет. Излучение, которое привносят структуры, находящиеся вне фокальной плоскости, может исказить изображение и привести к потере контраста, особенно при использовании объективов с высокой разрешающей способностью, например объективов с масляной иммерсией и высокой числовой апертурой. Деконволюция устранение или перерасчет зон размытости путем математической обработки плоскостей (оптических срезов) на цифровом изображении.

Конфокальная микроскопия

Формирование 3 D-изображения на основе последовательных оптических срезов

Микросферический наноскоп" (microsphere nanoscope), • Для получения изображения использует микросферы из оптически прозрачного кварцевого стекла. Затем изображения с этих микролинз увеличиваются обычным оптическим микроскопом. Наноскоп позволяет наблюдать объекты размером около 10 нм и получать высококачественные трехмерные 3 D изображения при нормальном уровне освещения.

Наноскоп Световой микроскоп

Метод авторадиографии Включение меченого тимидина в ДНК ядра

Включение меченого тимидина в клеточное ядро (радиоавтограмма) 3 НТимидин

Электронная микроскопия • Трансмиссионная • Сканирующая

• The wavelength of an electron decreases as its velocity increases. In an electron microscope with an accelerating voltage of 100, 000 V, the wavelength of an electron is 0. 004 nm. • In theory the resolution of such a microscope should be about 0. 002 nm, which is 10, 000 times that of the light microscope. • Because the aberrations of an electron lens are considerably harder to correct than those of a glass lens, however, the practical resolving power of most modern electron microscopes is, at best, 0. 1 nm • This is because only the very center of the electron lenses can be used, and the effective numerical aperture is tiny. Furthermore, problems of specimen preparation, contrast, and radiation damage have generally limited the normal effective resolution for biological objects to 2 nm. This is nonetheless about 100 times better than the resolution of the light microscope.

Ernst Ruska and Max Knoll built the first electron microscope in 1931 (Nobel Prize to Ruska in 1986)

Принципиальное устройство электронного микроскопа

Электронноплотные структуры Электроннопрозрачные структуры

Серийные срезы Конструирование объемного изображения

Сканирующий электронный микроскоп

Подготовка образца для сканирующей микроскопии

• A scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog. For comparison, the same structure is shown by (B) differential-interference-contrast light microscopy and (C) thin-section transmission electron microscopy

Cryo-electron microscopy (excerpted from Norman Olson, Purdue U. ) • Cryo-EM is TEM in vitreous ice – Vitreous ice is water frozen to -140° C in less than 10 -4 sec – Vitreous ice state must be maintained in microscope • Advantages of Cryo-EM – Preserves native structure of sample – Reduces electron beam damage – Allows examination of large, complex macromolecules • Disadvantages of Cryo-EM – Technically difficult – Samples are sensitive to beam damage – Images have low contrast

Визуализация мембранных рецепторов наночастицами золота Наночастицы золота АТ к рецептору Рецептор