Стволовые клетки в ЦНС Александрова М А ИБР

Стволовые клетки в ЦНС Александрова М. А. ИБР РАН 2012

Стволовые клетки в мозге. • • • Области мозга с НСК Нейрогенез Ниша стволовых клеток Происхождение НСК взрослого мозга Культивирование НСК Перспективы клеточной терапии НСК

1. Нейронная теория - нервная ткань состоит из нейронов, имеющих самостоятельное значение в анатомическом, генетическом, функциональном, трофическом, патологическом и поведенческом смысле. 2. Нейрон – поляризованная клетка 3. Нейроны развиваются из нейробластов и впоследствии никогда не делятся. S. Ramon y Cajal 1852 -1934

Изменение представлений о нейрогенезе в мозге млекопитающих за последние 20 лет.

Структуры мозга с нейрогенным потенциалом: субвентрикулярная зона и зубчатая извилина гиппокампа переднего мозга. Срез на уровне септодиенцефалической зоны мозга Срез на уровне каудального диенцефалона мозга

Science 1992. Science 1962. LV LV Пролиферация клеток в СВЗ мозга взрослых грызунов - Н 3 Т и БРДУ. LV Мультипликация НСК в культуре

Свойства стволовых клеток: • самовоспроизводимость • мультипотентность • репарация и регенерация поврежденных клеток и тканей • устойчивость к инфекции (MDR) • генетическая стабильность и высокая пролиферативная активность in vitro • пластичность

Нейрогенные области в мозгу взрослых позвоночных мышь птица рыба

Две области нейрогенеза в мозгу взрослых млекопитающих (van Praag et al. , Nature, 2002).

В мозге происходит постоянное обновление интернейронов обонятельной луковицы, за счет деления стволовых клеток в SVZ. Тканевая «ниша» стволовых клеток

Вновь образованные нейроны замещают погибшие нейроны в обонятельной луковице мозга

Ростральный путь миграции нейробластов в мозгу человека SCIENCE VOL 315 2 MARCH 2007

Архитектура ниши стволовых клеток в SVZ Cell Stem Cell 2008. C НСК Факторы и сигнальные молекулы ниши: BMPs, LIF, Wnt, FGF 2, EGF, VEGF, TGFa, Shh, PDGFa, Notch, PEGF B A прогениторы нейробласты

В нейрогенной нише SVZ взрослого мозга эпендимные клетки экспрессируют Noggin, который подавляет BMP астроцитов. Нейральная индукция ? Lim et al. , Neuron. 2000

Стволовые клетки в субгранулярной зоне гиппокампа взрослого мозга. (Fiona Doetsch. 2003. ) Стволовые клетки в обеих нишах экспрессируют GFAP+ - маркер астроцитов.

Механизмы нейрогенеза в гиппокампе взрослого мозга Duan et al. Curr Opin Neurobiol. 2009

Функциональный нейрогенез в зубчатой извилине гиппокампа у взрослых грызунов. V+GFP 4 weeks van Praag N. et al. Nature. 2002

Ниша стволовых клетоксложный клеточный комплекс из клеток эндотелия, астроцитов, нейронов, синаптических контактов и стволовых клеток Curr Opin Neurobiol. 2010

Происхождение стволовых клеток во взрослом мозге

Нервная пластинка представляет собой пласт нейроэпителиальных клеток, которые являются нейральными стволовыми клетками, поскольку из них развиваются нейроны и несколько типов глиальных клеток. Считается, что в процессе формирования нервной трубки стволовые клетки продуцируют: клетки радиальной глии и стволовые клетки нервного гребня.

Схема развития нервной системы позвоночных I. Мезодермальная индукция – Vg 1 (TGF-B), activin, BMP 2, 4, FGF, WNT, Noggin II. Нейральная индукция – noggin, follistatin, chordin

Нейральные стволовые клетки (НСК) образуют нервную пластинку, которая формирует нервную трубку

Стволовые клетки нейроэпителия нервной трубки трансформируются в клетки радиальной глии. basal М apical М N-Cadherin, Cx 43

Три пути возникновения нейронов из НСК при развитии неокортекса мозга млекопитающих Annu Rev Neurosci. 2011 May 3. ; 32: 149 -184.

Стволовые клетки генерируют нейроны и глию скоординировано во времени и пространстве Notch, Shh, BMP 4, FGF BMP 4, STAT 3, Notch WNT, Notch, Shh демитилирование астроциты mi. RNA-219, 338 Oligodendrocyte CP SVZ НСК VZ SVZ нейроэпителий Э-8 Радиальная глия 11 14 Астроциты взрослого мозга 18 П-0

Клетки радиальной глии протягивают свои отростки радиально от желудочка до наружной поверхности будущей коры мозга. Поверхность мозга SVZ VZ Желудочек мозга GFAP P. Rakic, 1972, 2003. GFAP

Инфекция клеток радиальной глии ретровирусом с GFP показала, что радиальная глия порождает нейроны. S. Noctor et al. J. Neurosci. 2002

Постнатально, радиальная глия в SVZ развивается в астроцитоподобные клетки A. Tramontin. Cereb Cortex, 2003 (GFAP+)

Астроцитоподобные клетки SVZ демонстрируют поведение и структурные компоненты характерные для нейроэпителия и радиальной глии Связь с желудочком и апикальное деление VZ VZ Клетки имеют одну ресничку, подобно клеткам нейроэпителия и радиальной глии A. Tramontin. Cereb Cortex, 2003

Глиальная природа НСК в развитии и во взрослом мозге Annu Rev Neurosci. 2011 Pax 6, Sox 1 -2, nestin Pax 6, GLAST, TN-C, S 100 b, vimentin, nestin, BLBP, RG Pax 6, GFAP, GLAST, TN-C, vimentin, SSEA 1, Musashi 1, TERT, ABCG 2, Notch(Hes 5)…

Клетки радиальной глии эмбрионального мозга в ходе онтогенеза приобретают фенотип астроцитов, сохраняя при этом стволовые свойства. Они обеспечивают постоянный нейрогенез в дифференцированном мозге. Число стволовых клеток с возрастом снижается.

Neural Stem and Progenitor Cells Retain Their Potential for Proliferation and Differentiation into Functional Neurons Despite Lower Number in Aged Brain Aging causes severe reduction of in vivo neurogenesis and loss of NSCs in SVZ. A–G, Proliferation as assessed by number of p-H 3(A) and Brd. U(B) cells, neuroblast formation (C) as assessed by Dcxcells, number of NSCs as assessed by number of nestin–GFPcells (D), and number of cells expressing the putative markers Sox 2 (E) and Gsh 2 (F ), and proliferative activity in NSCs and neuroblasts as assessed by the percentage Brd. U/Sox 2 and Brd. U/Dcxcells of the total number of Sox 2 and Dcx(G) cells, respectively, in adult and aged SVZ. J. Neurosci. , April 8, 2009 • 29(14): 4408– 4419 Ahlenius et al. • Aging and Neurogenesis

Древо клеточных типов, возникающих из НСК в развитии и во взрослом мозге Annu Rev Neurosci. 2011 May 3. ; 32: 149 -184.

Культивирование нейральных стволовых клеток

Нейральные стволовые клетки можно выделить из: • СВЗ мыши (Lois and Alvarez-Buylla, 1993), крысы (Palmer et al. , 1995) и человека (Kukekov et al. , 1999) • ЗИ гиппокампа крысы (Palmer et al. , 1995) и человека (Kukekov et al. , 1999) • обонятельной луковицы человека (Pagano et al. , 2000) и мыши (Gritti et al. , 2002) • из спинного мозга мыши (Weiss et al. , 1996) • спустя несколько часов после смерти: из СВЗ и спинного мозга мыши (Laywell et al. , 1999), из ОЛ человека (Roisen et al. , 2001), из СВЗ и гиппокампа человека (Palmer et al. , 2001)

Нет универсального маркера для нейральных стволовых клеток. Белки – маркеры НСК: SSEA-1, CD 133, Musashi-1, Notch, Numb, Presenilin, PSA-NCAM, FGFR 4, Fz 9, Sox 1, Sox 2, Pax 6, Nucleostemin и др. Сортинг НСК: SP популяция (выброс Hoechst 33342 механизмом ABCG 2 транспортера); по CD 133 Классический маркер Nestin- белок промежуточных филаментов нейроэпителиальных клеток (наиболее широко применяется)

Proc. Jpn. Acad. , Ser. B 86 (2010)

Передний мозг эмбриона человека 9 недель развития. виментин β-тубулин III Ki-67 ГФКБ PAX 6 V PROX 1 NANOG Ki-67 nestin β-tubulin III Oct 4 RPL 19 Ki-67 V V

Нейральные стволовые клетки в культуре ткани формируют нейросферы (клоны клеток) Нейроэпителиальные розетки Экспрессия MDR (ABCG 2). фазовый контраст BCRP мет синий Pax 6 nestin BCRP

НСК в нейросферах сохраняют временную последовательность генерации клеток

Экспрессия белков, маркеров дифференцировки в клетках нейросфер. nestin Адгезивная культура Нейросферы Pax 6 vim Nestin Nesttub vim β-tubulin Vimentin -tubulin GFAP β-tubulin GFAP

Поведение клеток при трансплантации in vivoважнейший критерий качества культуры НСК. Среда: b. FGF, EGF+ LIF GFAP human nuclei nestin human nuclei 20 сут- дегенерация 30 сут- пролиферация

Ксенотрансплантация культивированных клеток в мозг крыс, подвергнутых острой гипоксии. тр тр Human nuclei β-tubulin III nestin рец тр GFAP Human nuclei Nestin NF

Трансплантация культур НСК человека в травмированный спинной мозг крыс. nestin - human nuclei GFAP-human nuclei НОРМА Тр ТРАВМА Тр

Ксенотрансплантация культуры НСК человека в глаз кролика. Лазерная травма Human nuclei ЭРГ при каинатной ретинопатии норма 1 сут * Human nuclei 7 сут 30 сут Контроль 7 сут 30 сут Трансплантация

Болезнь Паркинсона The Journal of Clinical Investigation http: //www. jci. org Volume 120 Number 1 January 2010

Figure 1. Morphology of hemisphere slice cultures and grafts. (A) One day old organotypic hemisphere culture immediately after grafting of neurospheres (arrows indicate VMN). (B, C same frame) The macro -structure of coronal hemisphere slice cultures was preserved after 3– 5 weeks in vitro, with recognizable cortical and striatal areas and subventricular zone (Asterisk in B, cell-empty area in F, G). (C, E) DARRP 32 -expression was prominent in striatal cells, and confined to the striatum. (E) shows magnified area from panel (C). (B–E) DARRP 32 -expressing cells are clearly visible, (E) with soma and projections confined to the striatum. (D) Layered cortical cell populations remain clearly identifiable. (F, G same frame) Neurosphere integration sites in the host slices are identifiable by the GFP expression from grafted cells. Grafted dopaminergic neurons extend complex processes Optogenetic Monitoring of Stem Cell Grafts PLo. S ONE | www. plosone. org 3 March 2011

Optogenetic Monitoring of Stem Cell Grafts PLo. S ONE | www. plosone. org 3 March 2011

Инсульт – ишемия мозга

Murine Neural Stem/Progenitor Cells Protect Neurons against Ischemia by HIF 1 a–Regulated VEGF Signaling K. M. Harms, Lu Li, L. A. Cunningham* PLo. S ONE 2010 Молекулярные механизмы нейропротекции NSPC HIF 1 a VEGFR 2 (Flk 1/KDR) нейропротекция

Стратегия клеточной терапии Источники нейральных стволовых клеток Эмбриональный мозг Трансплантация клеток при нейродегенеративных заболеваниях в мозг, сетчатку и на периферию Культивирование нейральных стволовых/прогениторных клеток Сетчатка эмбрионального глаза Постнатальный мозг Успех трансплантаций складывается из способностей прогениторных клеток к миграции, дифференцировке, интеграции и экспрессии специфических факторов в тканях реципиента.

Компенсаторный и индуцированный эндогенный нейрогенез S. Goldman. Nat Biotechnology